重組脂肪氧合酶發(fā)酵條件優(yōu)化及其穩(wěn)定化研究.pdf

1、脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12)屬于氧化還原酶，能催化特定結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸形成含有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物。這種不穩(wěn)定化合物氧化面粉中面筋蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素，起到強(qiáng)筋、漂白的效果。由于LOX兼具面粉強(qiáng)筋和漂白的功效，具有替代化學(xué)面粉品質(zhì)改良劑的潛力，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。目前市場(chǎng)上商品級(jí)LOX尚未出現(xiàn)，而富含LOX的大豆粉存在成分復(fù)雜、效果不佳等缺點(diǎn)。雖然，有關(guān)LOX基因的克隆與異源表達(dá)

2、研究已很多，包括胞內(nèi)和胞外表達(dá)，但LOX產(chǎn)量均不是很高。
　　為了提高LOX的產(chǎn)量，本論文主要對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)LOX的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究，并優(yōu)化發(fā)酵條件。在此基礎(chǔ)上，對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)LOX的分批發(fā)酵條件及酶的穩(wěn)定化進(jìn)行了初步研究，旨在為L(zhǎng)OX工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。
　　主要研究結(jié)果分述如下:
　　1.重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧舍酶發(fā)酵條件優(yōu)化。首先，通過篩選碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽得到發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:大豆蛋白胨25 g/L，

3、酵母浸膏15 g/L，甘油6g/L，KH2PO45 g/L，MgSO4·7H2O2 g/L，MnCl2·4H2O0.05 g/L。其次，通過單因素試驗(yàn)確定誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、接種量、培養(yǎng)基初始pH和裝液量對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。最后，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從7個(gè)因素中篩選出對(duì)LOX產(chǎn)量具有顯著效應(yīng)的因素為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)基初始pH，并利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法分析以確定其

4、產(chǎn)酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，即誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600達(dá)到1.6、誘導(dǎo)時(shí)間34h、培養(yǎng)基初始pH7.0。在此條件下，LOX酶活力為21261.60±264.03U/mL，比優(yōu)化前的13553.96±46.64 U/mL提高了56.87％。
　　2.重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶分批發(fā)酵條件研究。以搖瓶最佳發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，在10 L發(fā)酵罐中測(cè)定重組菌的分批發(fā)酵過程曲線，確定在菌體密度為3.0、5.0、7.0左右的時(shí)候添加誘導(dǎo)劑，并通過分析菌體密度、甘油

5、濃度、溶氧、pH以及LOX酶活隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線，發(fā)現(xiàn)最適誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為對(duì)數(shù)期前期（OD600在3.0左右），LOX酶活為29498.40±244.38 U/mL;發(fā)酵過程中分別控制pH恒定在6.5、7.0、7.5，結(jié)果表明不同恒定pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有一定影響，當(dāng)pH恒定在較高水平對(duì)菌體生長(zhǎng)和重組LOX的表達(dá)均有促進(jìn)作用，其中pH7.0時(shí)酶活最高達(dá)到31568.16±492.77 U/mL，比優(yōu)化后提高了48.47％;通過控制發(fā)酵液的溶氧水平

6、恒定，菌體生長(zhǎng)顯著加快，24 h就能到穩(wěn)定期，溶氧開始出現(xiàn)反彈，相對(duì)而言，LOX酶活沒有很大提升，但發(fā)酵周期從64 h縮短到48 h左右，縮短了發(fā)酵周期。
　　3.重組脂肪氧合酶的穩(wěn)定化研究。通過單因素試驗(yàn)，對(duì)液體酶制劑貯藏中常用的穩(wěn)定劑進(jìn)行篩選，包括金屬鹽、糖類、多元醇、大分子聚合物、表面活性劑、氨基酸、蛋白酶抑制劑和防腐劑，確定對(duì)LOX酶液的酶活具有顯著保護(hù)效應(yīng)的穩(wěn)定劑，即氯化鎂、蔗糖和吐溫80，并初步確定了其最適濃度范圍。在