副豬嗜血桿菌ompP5、cdtABC免疫原性分析和間接ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)屬于革蘭氏陰性菌,來自于巴斯德菌科的嗜血菌屬,是革拉瑟氏病(Glasser)的病原體,長(zhǎng)期棲息在豬群上呼吸道,在機(jī)體免疫力低下時(shí)侵入機(jī)體引發(fā)嚴(yán)重的全身性疾病,典型臨床病變特征表現(xiàn)為以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎等,威脅當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)最重要細(xì)菌性病原之一,給當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前預(yù)防該病注射的疫苗為主要以高毒力血清型4型和5型菌株作為滅活苗,由于副豬嗜血桿菌血清

2、型眾多,菌株間毒力差異也較大,目前滅活苗能不同時(shí)對(duì)所有致病菌產(chǎn)生交叉保護(hù)。隨著對(duì)副豬嗜血桿菌高毒力菌株全基因組測(cè)序的完成,可以利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行基因工程疫苗的研究。本研究基于本實(shí)驗(yàn)室對(duì)5型高毒力副豬嗜血桿菌SH0165菌株測(cè)序完成及后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)18個(gè)在HPS流行菌株為保守基因或操縱子基因,選擇了ompP5、cdtABC基因進(jìn)行克隆表達(dá),并將三個(gè)蛋白分別免疫Balb/C小鼠研究其免疫原性。
　　 主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　

3、 1.副豬嗜血桿菌ompP5、cdtABC基因的克隆表達(dá)及免疫原性分析
　　 根據(jù)GenBank中的副豬嗜血桿菌序列設(shè)計(jì)引物,分別擴(kuò)增ompP5、cdtA、cdtB和cdtC基因,然后將四個(gè)基因分別克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)和pGEX-KG上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化后得到四種重組蛋白。將四種重組蛋白進(jìn)行乳化,免疫Balb/C小鼠,初次免疫弗氏完全佐劑,二次免疫弗氏不完全佐劑,二免兩周后用5

4、×LD50的副豬嗜血桿菌SH0165攻毒。并設(shè)立分組如下:試驗(yàn)組一(滅活全菌)、試驗(yàn)組二(ompP5)、試驗(yàn)組三(cdtA)、試驗(yàn)組四(cdtB)、試驗(yàn)組五(cdtC)、試驗(yàn)組六(ompP5+cdtA+cdtB+cdtC)和PBS對(duì)照組。通過監(jiān)測(cè)抗體發(fā)現(xiàn),cdtA和cdtC的免疫原性高于cdtB組,但低于全菌免疫組。而在免疫后的攻毒保護(hù)力實(shí)驗(yàn)中,cdtB重組蛋白免疫組保護(hù)率為60％高于cdtA(40％)和cdtC(40％)蛋白免疫組,與

5、滅活全菌免疫組保護(hù)率(60％)相同。ompP5蛋白的免疫原性和攻毒保護(hù)力(40％)均低于滅活全菌免疫。結(jié)果顯示四種重組蛋白都有一定的免疫原性,其中cdtB能提供與滅活全菌免疫相同的保護(hù)力。
　　 2.副豬嗜血桿菌間接ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　 利用四種重組蛋白作為包被抗原確定最佳包被濃度和血清稀釋濃度,并優(yōu)化其他相關(guān)反應(yīng)條件,建立了重組蛋白包被的間接ELISA檢測(cè)方法,并建立了滅活全菌包被抗原間接ELISA方法