含硫酸腦苷脂的靶向乳腺癌載紫杉醇液態(tài)氟碳納米微球的制備和評價.pdf

1、目的：本文將sulfatide和NPs連接起來作為PTX的給藥系統(tǒng)(sulfatide-perfluooctylbromide nanoparticles，SNPs)靶向乳腺癌進(jìn)行治療。將SNPs作為PTX的靶向納米傳遞載體，即含硫酸腦苷脂的靶向乳腺癌載紫杉醇液態(tài)氟碳納米微球(Paclitaxel-sulfatide-perfluooctylbromidenanoparticles，PTX-SNPs)。本文將PTX-SNPs作為PTX的

2、靶向納米載體進(jìn)行表征、細(xì)胞毒性以及體內(nèi)藥效學(xué)等研究。
　　研究方法：
　　第一部分:采用逆向蒸發(fā)方法成功制備PTX-SNPs。
　　第二部分:以小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6考察制劑對細(xì)胞的抑制作用，同時利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　第三部分:大鼠尾靜脈分別注射Taxol(@)、PTX-NPs、PTX-SNPs，給藥量為PTX10mg/kg。建立了高效液相(High Performance Liquid Chro

3、matography,HPLC)分析方法測定了大鼠血漿中PTX的濃度，并繪制血藥濃度曲線，研究了Taxol(@)、PTX-NPs、PTX-SNPs在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)。
　　第四部分:建立小鼠乳腺癌模型
　　結(jié)果：
　　1.PTX-SNPs的制備和評價
　　采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法制備PTX-SNPs。以DLC、DLE和粒徑作為主要考察指標(biāo)，通過單因素分析計算，確定脂質(zhì)的濃度(FactorA)、EPC和sulfatid

4、e的質(zhì)量比(Factor B)、PFOB的含量(Factor C)和PTX的用量(Factor D)四個因素為主要影響因素，并通過四因素三水平的正交實驗設(shè)計最終得出最佳處方為:脂質(zhì)的濃度(FactorA)為1.2mg/mL、EPC和sulfatide的質(zhì)量比40∶1、PFOB的體積含量(Factor C)為15％，PTX的用量（因素A）為1.3mg/mL。經(jīng)HPLC測定，優(yōu)化處方后PTX-SNPs中PTX的ELC為96.20％±0.14

5、％，DLC為1.24mg/mL。PTX-SNPs的粒徑為237.5nm，Zeta電位為-14.7±0.7，多分散系數(shù)為0.28±0.045，馬爾文測定粒徑分布均勻。PTX-SNPs外觀為具有藍(lán)色乳光，電鏡下觀測PTX-SNPs為規(guī)則的球形或類球形，粒徑與馬爾文檢測結(jié)果基本一致。通過HPLC測定Taxol(@)、PTX-NPs和PTX-SNPs的釋放。透析14h時，Taxol(@)中PTX的釋放率已經(jīng)接近100％;PTX-SNPs和PTX

6、-NPs中PTX的釋放率分別為52.78％±1.29％和49.78％±1.28％。透析60h時，PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放率分別為87.44％±1.78％和80.80％±1.74％。PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放特點是最初爆發(fā)性釋放，接著是持續(xù)、緩慢的釋放。
　　2.PTX-SNPs的細(xì)胞毒作用
　　為了考察PTX-SNPs對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，采用MTT法測定比較幾種制劑

7、對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。與PTX-SNPs作用后的EMT6小鼠乳腺癌細(xì)胞的活性低于游離PTX和PTX-NPs作用后的EMT6小鼠乳腺癌細(xì)胞的活性。在與PTX濃度為10μg/mL的PTX溶液、PTX-SNPs和PTX-NPs作用48h后的小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞早期凋亡率分別為3.9％±0.3％，4.6％±0.6％和13.6％±0.5％。當(dāng)PTX濃度上升到30μg/mL時，早期凋亡率分別增長至13.1％±0.2％，13.3％

8、±0.2％和44.9％±1.7％。
　　我們由結(jié)果推測PTX-SNPs與小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞共同培養(yǎng)時，細(xì)胞中藥物濃度分別高于與PTX-NPs和游離PTX共同作用的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。本文以Coumarin6為模型藥物，聯(lián)合靶向阻斷實驗，驗證該推測。結(jié)果顯示與Coumarin6-SNPs共同作用2h時，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分別是Coumarin6-NPs和Coumarin6組的1.9倍和2.0倍。與Coumarin6-SNPs共同作用12

9、h時，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的趨勢和共同作用2h時趨勢一致。
　　3.PTX-SNPs在大鼠血漿中的濃度和小鼠組織中的分布
　　Taxol(@)在大鼠血漿中的藥物濃度在給藥2h之內(nèi)呈現(xiàn)快速消除相，在給藥8h時血漿中已經(jīng)檢測不到PTX的濃度。PTX-SNPs和PTX-NPs在大鼠血漿中的藥物濃度在給藥2h之內(nèi)也呈現(xiàn)一個快速的消除相，隨后2-8h之間伴隨相對緩慢的消除，8h以后到24h之間伴隨速度非常緩慢的消除，血藥濃度一直維持在較低的

10、水平。
　　PTX-SNPs和PTX-NPs給藥后PTX在組織中的分布不同于Taxol(@)，作為納米制劑注射PTX-SNPs和PTX-NPs后，PTX在小鼠肝臟和脾臟的分布比注射Taxol(@)組在肝臟和脾臟的分布高。PTX-SNPs給藥后，PTX在小鼠腫瘤組織的藥物濃度明顯大于PTX-NPs和Taxol(@)給藥后的藥物濃度。
　　4.PTX-SNPs對荷EMT6乳腺癌小鼠的治療作用
　　PTX-SNPs、PTX-

11、NPs和Taxol(@)治療后的抑瘤率(Tumor inhibition ratio，TIR)分別為70.8％、45.6％和34.0％;體積雙倍時間(Double time，DT)分別為(11.8±2.2)、(6.3±0.4)和(5.8±0.4)天。這說明PTX-SNPs對小鼠EMT6乳腺癌的治療效果優(yōu)于PTX-NPs和Taxol(@)的治療效果。腫瘤增長曲線和第20天稱重的腫瘤重量也和以上結(jié)果吻合。TUNEL腫瘤組織凋亡實驗結(jié)果顯示P

12、TX-SNPs組凋亡率為46.83％±4.9％明顯高于PTX-NPs(30.91％±3.52％)和Taxol(@)(24.27％±5.32％)等其他各組。同時免疫組化實驗如MVD和Bad實驗同樣驗證了PTX-SNPs可以通過促進(jìn)腫瘤Bad的分泌和減少腫瘤MVD的生長，從而有效的促進(jìn)乳腺癌組織細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　本課題研究成功制備了PTX-SNPs靶向給藥系統(tǒng)。外觀有藍(lán)色乳光，透射電鏡下形態(tài)為球形或類球形。ELC為96

13、.20％±0.14％，DLC為1.24mg/mL。PTX-SNPs的粒徑為237.5nm，Zeta電位為-14.7±0.7，多分散系數(shù)為0.28±0.045，馬爾文測定粒徑分布均勻。腫瘤狀態(tài)中的血管內(nèi)皮間隙擴(kuò)大，允許直徑小于700nm的顆粒穿過。PTX-SNPs的粒徑在200nm左右，為SNPs可以通過毛細(xì)管到達(dá)腫瘤細(xì)胞傳遞PTX提供了條件。PTX-SNPs外觀具有藍(lán)色乳光。體外模擬體內(nèi)條件透析14h時，Taxol(@)中PTX的釋放率

14、已經(jīng)接近100％;PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放率分別為52.78％±1.29％和49.78％±1.28％。透析60h時，PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放率分別為87.44％±1.78％和80.80％±1.74％。PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的釋放特點是最初爆發(fā)性釋放，接著是持續(xù)、緩慢的釋放。在體外模擬環(huán)境中的釋放相比較Taxol(@)具有延遲效果，推測是因為磷脂單層膜對藥物釋放起到閥門和控制膜

15、的作用。
　　通過測定和比較PTX-SNPs、PTX-NPs和Taxol(@)三種制劑對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明PTX-SNPs比PTX-NPs和Taxol(@)對小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。接著又通過早期凋亡率的測定驗證了在共同作用48h時PTX-SNPs比PTX-NPs和Taxol(@)具有更強(qiáng)的促小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞凋亡的作用。以Coumarin6作為模型藥物，通過細(xì)胞攝取載體包載藥物的實

16、驗，證實Coumarin6-SNPs相比Coumarin6-NPs和Coumarin6，可以將更多的Coumarin6傳遞到小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞中。靶細(xì)胞中藥物濃度高，自然因為藥物產(chǎn)生的殺傷力也更強(qiáng)。
　　測定不同處方給藥后PTX在大鼠體內(nèi)的血藥濃度曲線和小鼠體內(nèi)的組織分布，PTX-SNPs已經(jīng)改變了PTX的藥動學(xué)行為和組織分布。PTX-SNPs在大鼠血漿中半衰期比Taxol(@)長，在小鼠體內(nèi)EMT6腫瘤、肝臟和脾臟中分布較T

17、axol(@)多。靶部位藥物濃度高，治療作用強(qiáng)。因此，本文也開展了PTX-SNPs治療荷EMT6乳腺癌小鼠的初步藥效學(xué)研究。通過測量腫瘤體積、繪制體積-時間增長曲線，腫瘤稱重計算的DT、TIR等指標(biāo)，共同驗證了PTX-SNPs在小鼠體內(nèi)治療EMT6乳腺癌的療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于PTX-NPs和Taxol(@)。TUNEL實驗和免疫組化實驗結(jié)果顯示PTX-SNPs可以促進(jìn)乳腺癌組織細(xì)胞凋亡和腫瘤壞死因子Bad的分泌，同時減少腫瘤MVD的生長。這些都