茶樹原花青素的積累形態(tài)及縮合反應(yīng)的研究.pdf

1、茶樹(Camellia sinensis(L.) O.Kuntze)中含有豐富的酚類物質(zhì)，統(tǒng)稱為茶多酚，包括黃酚酸類、烷醇類、黃酮醇類、黃酮類、花青素類等。酚類物質(zhì)是茶樹的主要次生代謝產(chǎn)物之一，對(duì)決定茶葉品質(zhì)及其健康功效具有重要作用。本文利用分離純化鑒定及分子生物學(xué)等技術(shù)手段，對(duì)茶樹PAs等酚類物質(zhì)的純化鑒定和組織器官特異性合成及積累進(jìn)行了研究，主要研究結(jié)果如下。
　　1.茶樹酚類物質(zhì)積累的組織器官特異性
　　本文利用液相串

2、聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-TOF-MS、UPLC-QQQ-MS/MS)，一次性定性了50種酚類物質(zhì)，并且基于多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(MRM)，對(duì)其中的29種酚類物質(zhì)進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，大部分酚類物質(zhì)積累在幼嫩的葉中，莖和根中積累相對(duì)較低，但是根中卻大量積累了PAs。這一結(jié)果推進(jìn)了人們對(duì)茶樹根中多酚類物質(zhì)積累的認(rèn)識(shí)。
　　運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)和聚類分析的技術(shù)，對(duì)莽草酸途徑、苯丙烷途徑以及類黃酮途徑的63個(gè)結(jié)構(gòu)基因以及調(diào)節(jié)基因的

3、表達(dá)模式進(jìn)行了分析。根據(jù)表達(dá)模式的聚類分析結(jié)果，這些基因被分為兩個(gè)主要的組，即C1和C2，其中C1組的基因主要是在根中高表達(dá)或者在芽和葉中低表達(dá)。而C2-2-1組和C2-2-2-1組基因主要與不同發(fā)育時(shí)期的葉中酚類物質(zhì)的積累相關(guān)。酯化酶和水解酶的酶學(xué)分析則顯示，兒茶素類的積累同時(shí)受合成與分解的影響。
　　2.茶樹不同組織器官原花青素PAs的分離純化、鑒定及定量分析
　　本文首先對(duì)茶樹根中PAs的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出最佳

4、的提取工藝條件：提取溶液為80％丙酮加0.25%乙酸、提取時(shí)間為35 min、提取溫度為50℃。再利用GF254硅膠板、硅膠柱純化、制備型液相技術(shù)，對(duì)茶樹根中聚合的PAs進(jìn)行純化，并用1H-NMR技術(shù)進(jìn)行了分析，說明根中PAs的連接方式為C4-C6或C4-C8，組成單位是B環(huán)二羥基的、順式的以及非沒食子化簡單兒茶素(EC)。茶樹根中純化的PAs，經(jīng)正丁醇-HCl熱解和分離純化后，可以得到純度大于98%的矢車菊色素單體。
　　本文運(yùn)

5、用熱解、硫解、NP-HPLC、HPLC-ESI-MS、MALDI-TOF-MS和13C-NMR技術(shù)，對(duì)茶樹不同組織器官中原花青素進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示，在葉中，當(dāng) PAs的聚合度較小時(shí)，B環(huán)二羥基和三羥基的結(jié)構(gòu)單元同時(shí)存在，C2-cis形式的是主要的結(jié)構(gòu)單元；當(dāng)原花青素PAs聚合度大于5后，主要的聚合單位為EC；并且葉中包含有大量的單體兒茶素(EGCG、ECG、EGC和EC)。相比之下，在根中，兒茶素主要是以聚合的形式存在，盡管原花青素

6、含量高且聚合度高，但是結(jié)構(gòu)單元單一，EC是主要的結(jié)構(gòu)單元。
　　本文對(duì)茶樹原花青素PAs的檢測方法—香草醛法、對(duì)二甲氨基肉桂醛(DMACA)法進(jìn)行了系統(tǒng)性的優(yōu)化，結(jié)果表明香草醛法最優(yōu)條件：反應(yīng)溫度0～25℃、反應(yīng)時(shí)間15 min、硫酸體積分?jǐn)?shù)為50%、香草醛濃度為10 g/L。對(duì)二甲氨基肉桂醛(DMACA)法最優(yōu)條件：0℃、5 min內(nèi)、鹽酸濃度為1.2 mol/L、DMACA濃度為2 g/L。為了驗(yàn)證方法的靈敏度，本文分別以EC

7、(單體)、B2(二聚的PAs)和純化的根的PAs混合物(聚合的PAs)為標(biāo)準(zhǔn)品，采用各種化合物與試劑顯色的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率反映它們的顯色靈敏度，結(jié)果顯示用香草醛-H2SO4，DMACA-HCl和正丁醇-HCl熱水解方法，得到顯色的靈敏度差異很大。例如用純化的根PAs作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別用香草醛-H2SO4，DMACA-HCl和正丁醇-HCl方法，測得的根中PAs的含量分別為121.77 mg/g，104.32 mg/g和85.06 mg/g。

8、而通過分離純化方法定量根中PAs含量為8.1%。純化方法的定量結(jié)果與正丁醇-HCl實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更接近。
　　3.茶樹PAs縮合機(jī)理的初步研究
　　為了研究PAs聚合機(jī)理，本文探究了黃烷-3-醇的自動(dòng)縮合反應(yīng)機(jī)理。結(jié)果顯示，以單體黃烷-3-醇為底物時(shí)，不管是在酸性還是堿性環(huán)境下，簡單兒茶素都可以在室溫條件下非酶性縮合形成不同的二聚體。但是，這些二聚體與茶樹體內(nèi)的并不相匹配，推測這些二聚體可能是茶樹鮮葉中并不存在的體外氧化產(chǎn)物。當(dāng)