低強(qiáng)度超聲波對(duì)熱帶假絲酵母的促增殖效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、目前微生物發(fā)酵存在種子液接種量大、接種成本高等問題。一些研究發(fā)現(xiàn)，通過低強(qiáng)度超聲適度預(yù)處理種子液，能夠大幅增加種子液中的菌含量。但是超聲促微生物增殖的機(jī)制缺乏系統(tǒng)性的研究，需要開展深入探索以揭示其生物學(xué)機(jī)制。本研究以熱帶假絲酵母菌（Candida tropicalis）為對(duì)象，研究了超聲場(chǎng)引起的熱帶假絲酵母細(xì)胞增殖、形態(tài)、細(xì)胞膜通透性等生物學(xué)變化，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)闡釋低強(qiáng)度超聲調(diào)控?zé)釒Ъ俳z酵母細(xì)胞周期的分子機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下：

2、
　　（1）以生物量增加量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別研究了超聲波對(duì)熱帶假絲酵母和釀酒酵母的促增殖作用。結(jié)果表明：熱帶假絲酵母菌的生長(zhǎng)時(shí)期、超聲頻率、超聲功率以及超聲時(shí)間等都會(huì)對(duì)超聲場(chǎng)的增殖效果產(chǎn)生影響。其中熱帶假絲酵母的最佳超聲處理?xiàng)l件：對(duì)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)中期的熱帶假絲酵母菌液以頻率28 kHz、功率密度120 W/L超聲處理1 h，菌體生物量增加量達(dá)到最大值148.5％。釀酒酵母的最佳超聲條件：對(duì)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)前期的釀酒酵母菌液以頻率68 kH

3、z、功率密度120 W/L超聲處理2 h，菌體生物量增加量達(dá)到最大值44.2%。結(jié)果顯示超聲波對(duì)熱帶假絲酵母的促增殖效果比釀酒酵母更好，增殖穩(wěn)定性也優(yōu)于釀酒酵母，因而后期選用熱帶假絲酵母作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。
　?。?）研究了超聲處理對(duì)熱帶假絲酵母的形態(tài)、酶活、細(xì)胞膜通透性以及胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母菌經(jīng)過適宜的超聲處理后，數(shù)量增多、菌絲變長(zhǎng)，且在菌絲周圍簇?fù)碇湍感蜔釒Ъ俳z酵母。此外超聲對(duì)堿性蛋白酶和中

4、性蛋白酶的活性影響不大，超聲波處理酸性蛋白酶<5h對(duì)其活性無明顯影響，處理5 h以后可增加其活性約20%。而胞外蛋白質(zhì)和核酸的滲出濃度起初隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，超聲2 h左右達(dá)到頂峰（蛋白質(zhì)提高5.8%，核酸提高12.4%），而后逐漸變緩，4 h恢復(fù)到原來的水平，之后再次提高。
　　采用Fluo-4/AM熒光探針法研究了超聲作用下胞內(nèi)Ca2+跨膜行為。結(jié)果顯示Fluo-4/AM熒光探針在熱帶假絲酵母菌體中最優(yōu)負(fù)載濃度為7μmol

5、/L，最優(yōu)孵育時(shí)間為60min，最優(yōu)孵育溫度為30℃。經(jīng)過低強(qiáng)度超聲處理后熱帶假絲酵母菌落總數(shù)上升，同時(shí)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度下降，超聲2 h后下降至最大值為25.8%；而經(jīng)過約5 h左右超聲處理后菌落總數(shù)下降，胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度上升。結(jié)果表明經(jīng)過不同時(shí)間低強(qiáng)度超聲處理后，短時(shí)間的超聲有利于細(xì)胞增殖，超聲使熱帶假絲酵母Ca2+跨膜行為發(fā)生了改變，推測(cè)是超聲處理改變了細(xì)胞膜的通透性。
　?。?）采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選差異表達(dá)基因并進(jìn)

6、行系列分析。結(jié)果顯示，低強(qiáng)度超聲對(duì)熱帶假絲酵母促增殖效應(yīng)所涉及的基因是 CTRG-02711、CTRG-03249、CTRG-02500、CTRG-00817、CTRG-00897、CTRG-01717、CTRG-05491。它們分別上調(diào)了約6.7倍、5.5倍、1.7倍、1.9倍、1.7倍、14.4倍以及1.5倍。它們的GO分別涉及到細(xì)胞表面、高爾基體、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控以及DNA復(fù)制起始，推測(cè)超聲作用從影響熱帶假絲酵母細(xì)胞膜開始逐

7、漸向細(xì)胞內(nèi)部作用，最后到達(dá)DNA復(fù)制環(huán)節(jié)，通過途徑中相應(yīng)的基因及通路上調(diào)，引起熱帶假絲酵母的增殖。
　　結(jié)合差異表達(dá)分析，超聲促增殖效應(yīng)的關(guān)鍵基因是 CTRG-01717（phosphatidylinositol3-kinase TOR2），其基因表達(dá)上調(diào)14.4倍，TOR2基因與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物是磷脂酰肌醇（PI）3激酶。在GO富集分析和KEGG富集分析結(jié)果表明，TOR2屬于GO分子功能top20中Prot

8、ein serine/threonine kinase activity（蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性）和KEGG pathway top20中PI3K-Akt signaling pathway（磷脂酰激醇-3-羥激酶信號(hào)通路）， AMPK signaling pathway（蛋白激酶信號(hào)通路）的基因。其中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子，PI3K-Akt信號(hào)通路的作用是抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖，都體現(xiàn)了低強(qiáng)度超聲對(duì)熱帶假