納米羥基磷灰石-聚氨基酸復合材料的制備與應用研究.pdf

1、骨折是臨床常見疾病，常需外科內(nèi)固定手術(shù)處理以恢復骨的連續(xù)性和完整性。因此，內(nèi)固定材料成為常用的醫(yī)療物質(zhì)之一。內(nèi)固定材料主要分金屬生物內(nèi)固定材料和非金屬生物內(nèi)固定材料。醫(yī)用金屬材料是一類生物惰性材料，除具有較高的機械強度、抗疲勞性能外，還具有一定的抗生理腐蝕性、無毒性和簡易可行以及確切的手術(shù)操作技術(shù)。因此，金屬材料成為目前臨床內(nèi)固定材料中應用最廣泛的材料。然而，由于金屬材料的高強度固定常常導致應力遮擋，骨折新生骨痂生長緩慢，皮質(zhì)變??；另外

2、，金屬材料常常需二次取出，增加了患者的痛苦和經(jīng)濟負擔，嚴重者甚至在二次取出時或取出后造成再次骨折。所以，目前國、內(nèi)外許多學者都在研究新的生物內(nèi)固定材料以替代和避免金屬材料的應用缺陷。
　　 納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite，n-HA)是人及動物骨骼、牙齒的主要無機成分，因此具有良好的生物相容性和生物活性。n-HA在植入人體后能在短時間內(nèi)與人體的軟組織及硬組織形成緊密結(jié)合而成為廣泛應用的植骨代用品。然而，n-

3、HA作為燒結(jié)材料表現(xiàn)出的脆性及抗疲勞性能差等缺點，阻礙了其臨床應用。因此，理論上可以具備良好生物活性，又具備良好力學性能及降解性能的n-HA復合材料逐漸成為目前研究的熱點。
　　 聚氨基酸(poly-amino acid，PAA)是由一種或者多種氨基酸聚合而成的一類在一次結(jié)構(gòu)上以肽鍵為重復單元的可降解線型高分子材料。由于PAA具有良好的降解性能和生物相容性，因此在醫(yī)用修復材料領(lǐng)域具有廣泛的應用潛力。但是，PAA的溶解性和可加工性

4、能差，極大地限制了PAA的應用。為此，四川大學嚴永剛教授等在總結(jié)現(xiàn)有PAA和聚酰胺材料以及其他現(xiàn)有醫(yī)用高分子的基礎(chǔ)上，設(shè)計發(fā)明了一類新型多元PAA高分子材料。這類高分子由6-氨基己酸作為主鏈，將人體所含有的α-氨基酸作為共聚單元。其中，6-氨基己酸賦予聚合物良好的力學性能和可加工性能，而其它共聚天然氨基酸單體可調(diào)節(jié)聚合物材料物理化學性能如親、疏水性能、降解速率、降解產(chǎn)物及pH值等。
　　 本實驗擬利用原位聚合法制備新型的n-HA

5、/PAA復合材料，在綜合分析材料的表征、組成與結(jié)構(gòu)、降解性能、力學性能、親水性以及體內(nèi)、外生物相容性的基礎(chǔ)上，通過內(nèi)固定實驗動物骨折以評價其作為內(nèi)固定材料的可行性，為將來可能的臨床應用提供科學的實驗依據(jù)。
　　 目的：利用原位聚合法制備一種新型的n-HA/PAA復合材料，綜合分析該材料的組成、結(jié)構(gòu)特征以及降解和力學性能等；評價該材料的體內(nèi)、外生物安全性與相容性；通過制作實驗動物股骨髁間骨折模型，以n-HA/PAA復合材料固定棒內(nèi)

6、固定骨折，評價n-HA/PAA復合材料作為內(nèi)固定材料的可行性。為n-HA/PAA復合材料固定棒的臨床應用提供科學的實驗依據(jù)。
　　 方法：本實驗共由四部分組成：
　　 1.n-HA/PAA復合材料的制備與性能研究：
　　 利用原位聚合法制備不同n-HA質(zhì)量比的n-HA/PAA復合材料；利用燃燒測試及掃描電鏡觀察復合材料中無機成分n-HA的分布；紅外光譜及X線衍射觀察復合材料的組成與結(jié)構(gòu)；力學實驗檢測復合材料的初始

7、力學性能；模擬體液浸泡實驗研究材料的降解性能及親水性。
　　 2.n-HA/PAA復合材料體外細胞相容性研究，本實驗由兩部分實驗組成。
　　 實驗一、n-HA/PAA復合材料與L929細胞毒性檢測：
　　 通過直接接觸和浸提液接觸法將n-HA/PAA材料與L929細胞共同培養(yǎng)后觀察材料對L929細胞的形態(tài)學影響：MTT法檢測L929細胞增值度；Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞儀檢測L929細胞凋亡

8、。
　　 實驗二：n-HA/PAA復合材料與MG63成骨樣細胞體外相容性研究：
　　 通過n-HA/PAA材料與MG63細胞共同培養(yǎng)后利用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、DAPI熒光染色觀察材料周圍及表面MG63細胞的形態(tài)變化；MTT法檢測MG63細胞吸光度值變化；以IFCC推薦法測定MG63細胞堿性磷酸酶活力變化；酶聯(lián)免疫法檢測MG63細胞骨鈣素含量；流式細胞儀檢測MG63細胞周期及Annexin V-FITC/PI雙標記流

9、式細胞儀檢測MG63細胞凋亡情況。
　　 3.n-HA/PAA復合材料體內(nèi)組織相容性研究，本實驗由兩部分實驗組成。
　　 實驗一、n-HA/PAA復合材料肌肉內(nèi)埋植實驗：
　　 選擇聚乙烯對照研究n-HA/PAA復合材料肌肉埋植實驗。觀察n-HA/PAA材料在肌肉埋植24周內(nèi)其周圍肌肉組織大體情況、HE組織切片、透射電鏡觀察n-HA/PAA材料對肌肉組織的影響，同時檢測n-HA/PAA材料埋植后的失重率及X線衍射

10、分析材料可能的降解方式。
　　 實驗二、n-HA/PAA復合材料骨內(nèi)埋植實驗：
　　 選擇聚乙烯對照研究n-HA/PAA復合材料脛骨埋植實驗。觀察材料在脛骨埋植24周內(nèi)其周圍骨組織大體情況、硬組織切片觀察材料對骨組織的影響、掃描電鏡觀察材料-骨界面結(jié)合情況，同時通過對比檢測實驗動物骨內(nèi)植入前后血常規(guī)以及生化指標評價材料對全身的安全性影響。
　　 4.n-HA/PAA固定棒固定股骨髁間骨折的實驗研究：
　　

11、 制作新西蘭大白兔股骨髁間骨折模型，使用n-HA/PAA復合材料固定棒及克氏針對照固定骨折。影像學觀察骨折愈合情況；硬組織切片觀察材料與骨界面的結(jié)合；力學推出實驗檢測材料與骨界面的結(jié)合力。
　　 結(jié)果：
　　 1.n-HA/PAA復合材料的制備與性能研究：
　　 原位聚合法可以成功制備n-HA/PAA復合材料。該材料經(jīng)燃燒實驗及掃描電鏡觀察結(jié)果表明n-HA在復合材料中分布均勻，n-HA/PAA復合材料均一性好；紅

12、外光譜及X線衍射分析結(jié)果表明n-HA與PAA之間由化學鍵結(jié)合，而非機械結(jié)合方式；體外初始力學測試表明含10wt％、20wt％、30wt％、40wt％n-HA的復合材料的壓縮強度分別為140.65±10.26Mpa、128.44±9.92Mpa、117.74±9.21Mpa、62.41±6.25Mpa；彎曲強度分別為125.46±9.96Mpa、105.34±8.75Mpa、92.16±8.59Mpa、52.23±5.31Mpa；剪切強度

13、分別為70.15±6.21Mpa、60.61±5.36Mpa、52.89±5.63Mpa、22.11±4.21Mpa，彎曲模量分別為15.69±2.68Gpa、12.18±2.03Gpa、9.16±1.88Gpa、5.01±0.82Gpa；模擬體液浸泡實驗提示n-HA/PAA復合材料具有降解性，10％～40％n-HA質(zhì)量比的復合材料12W失重率分別為6.97±0.63％、8.16±0.81％、17.98±1.69％、32.16±2.11

14、％；彎曲強度隨降解而下降，至12W時分別為102.39±8.21Mpa、90.1±7.89Mpa、75.59±7.66Mpa、25.63±3.69Mpa；30wt％及40wt％質(zhì)量比n-HA復合材料具有良好的穩(wěn)定的親水性，各時間點親水率可分別達10％和15％左右。
　　 2.n-HA/PAA復合材料體外細胞相容性研究實驗一、n-HA/PAA復合材料與L929細胞毒性檢測研究：
　　 體外細胞毒性實驗觀察n-HA/PAA復

15、合材料對L929細胞形態(tài)及生長無明顯影響，MTT檢測實驗組細胞毒性為1級，流式細胞儀檢測n-HA/PAA復合材料不會引起細胞凋亡。
　　 實驗二：n-HA/PAA復合材料與MG63成骨樣細胞體外相容性研究：
　　 n-HA/PAA復合材料對MG63細胞形態(tài)無明顯影響，材料周圍及表面MG63細胞貼壁生長良好，并隨時間增加而細胞數(shù)逐漸增多。MTT檢測MG63細胞吸光度值隨培養(yǎng)時間逐漸增加，細胞增殖明顯，兩組間各時間點比較無明

16、顯差異(P>0.05)。MG63細胞ALP活力及骨鈣素含量隨培養(yǎng)時間逐漸增加，兩組比較無明顯差異(P>0.05)。各組材料對MG63細胞的生長周期及凋亡無明顯影響，且各時間點MG63細胞周期及凋亡細胞比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.n-HA/PAA復合材料體內(nèi)組織相容性研究。
　　 實驗一、n-HA/PAA復合材料肌肉內(nèi)埋植實驗：
　　 埋植期內(nèi)，n-HA/PAA復合材料與聚乙烯對照組結(jié)果類似。n-H

17、A/PAA復合材料不會引起周圍肌肉組織異常炎癥反應、免疫反應及異物排斥反應。體內(nèi)埋植24Wn-HA/PAA復合材料失重率為10％左右；X線分析結(jié)果表明復合材料為表面腐蝕降解。
　　 實驗二、n-HA/PAA復合材料骨內(nèi)埋植實驗：
　　 埋植期內(nèi)，n-HA/PAA復合材料與聚乙烯同樣不會引起周圍骨組織異常炎癥反應、免疫反應及骨溶解破壞或骨髓炎；掃描電鏡提示復合材料植入后逐漸與骨組織結(jié)合緊密，表面被新生骨組織覆蓋；且n-HA

18、/PAA復合材料對實驗動物肝、腎臟及血常規(guī)、生化指標無明顯影響。
　　 4.n-HA/PAA固定棒固定股骨髁間骨折的實驗研究：
　　 與克氏針對照組比較，n-HA/PAA固定棒具有同樣的骨折內(nèi)固定效應。硬組織切片提示實驗組材料-骨界面結(jié)合更好，推出力學實驗提示固定骨折早期兩組比較無明顯差別(P>0.05)，而4周及以后實驗組與骨的結(jié)合力明顯優(yōu)于克氏針對照組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.原位聚

19、合法可以成功制備n-HA/PAA復合材料。n-HA與PAA通過化學鍵緊密結(jié)合，該復合材料具有良好的親水性、力學性能與降解性能。
　　 2.n-HA/PAA復合材料對L929細胞無明顯細胞毒性。
　　 3.n-HA/PAA復合材料與MG63細胞具有良好細胞相容性。
　　 4.n-HA/PAA復合材料體內(nèi)埋植具有良好組織相容性；該材料在體內(nèi)以表面腐蝕的方式降解。
　　 5.n-HA/PAA復合材料固定棒可有效