腎移值受者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其亞群的臨床研究.pdf

1、腎移植受者需終身服用免疫抑制劑，但目前的臨床檢測(cè)指標(biāo)難以反映患者是否處在過度免疫抑制狀態(tài)、抑或是免疫排斥狀態(tài)，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床調(diào)整免疫抑制方案，進(jìn)而避免感染和降低排斥，達(dá)到個(gè)體化用藥。另外，聯(lián)合造血干細(xì)胞和移植已經(jīng)成功誘導(dǎo)了對(duì)供者抗原特異性免疫耐受，但缺乏特異性檢測(cè)指標(biāo)反映患者的耐受狀態(tài)，成為臨床上誘導(dǎo)移植耐受的主要障礙之一。調(diào)節(jié)性T(regulatoryT cells，Treg)細(xì)胞具有對(duì)抗原低反應(yīng)性和抑制免疫應(yīng)答的功能，其與效應(yīng)性T

2、(effect T cells，Teff)細(xì)胞之間的平衡是受者免疫狀態(tài)的主要決定因素。
　　2009年7月，專注于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞研究的Miyara M小組研究發(fā)現(xiàn)：CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞存在功能異質(zhì)性，依據(jù)其體外抑制功能可分為：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抑制功能的CD4+CD45RA+Foxp3lo靜息性Treg(restingregulatory T cells，rTreg)，具有較強(qiáng)抑制功能的CD4+CD45RA-Fo

3、xp3hi活化性Treg(activated regulatory T cells，aTreg)，體外不具有抑制功能的CD4+CD45RA-Foxp3lo分泌細(xì)胞因子的Treg(cytokine-secreting regulatory T cells，cytokine-secreting Treg)，這三群細(xì)胞在臍帶血、老年人、自身免疫疾病患者體內(nèi)具有不同的比例，與患者免疫狀態(tài)密切相關(guān)。
　　鑒于此，本研究擬通過檢測(cè)腎移植受者外

4、周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其亞群的變化來監(jiān)測(cè)受者免疫狀態(tài)。比較正常人群、腎功能穩(wěn)定受者和急性排斥受者外周血中Treg及其亞群的差異，研究腎移植術(shù)后Teff和Treg間平衡的變化，闡明不同免疫狀態(tài)腎移植受者免疫格局的特征。同時(shí)，動(dòng)態(tài)觀察造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植受者外周血中Teft和Treg及其亞群的變化，初步探索Treg及其亞群在誘導(dǎo)免疫耐受中的作用，尋找具有高度特異性和靈敏度的能準(zhǔn)確診斷患者不同免疫狀態(tài)的細(xì)胞亞群和分子標(biāo)志，從而為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床個(gè)

5、體化用藥甚至誘導(dǎo)移植耐受的產(chǎn)生提供依據(jù)。
　　第一部分 比較腎功能穩(wěn)定和急性排斥受者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的變化
　　目的：本部分通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎移植受者外周血中不同分子標(biāo)志的Treg細(xì)胞(如：CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+Foxp3+T細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3-T細(xì)胞)的比例，結(jié)合受者的腎功能穩(wěn)定狀態(tài)和急性排斥狀態(tài)，與正常人群進(jìn)行比較，觀察腎移植受者外周血中Treg

6、細(xì)胞比例的變化規(guī)律。
　　方法 本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了2008年-2010年2月于我院行腎移植手術(shù)的44例受者外周血中Treg細(xì)胞的比例，根據(jù)血清肌酐及移植腎穿刺活檢病理，將其分為腎功能穩(wěn)定組和急性排斥組，并與20例健康志愿者作為對(duì)照。
　　結(jié)果：(1)與正常人群相比，腎功能穩(wěn)定組表達(dá)CD25及Foxp3的細(xì)胞比例變化不明顯，而急性排斥組CD4+CD25+T和CD4+Foxp3+T細(xì)胞比例均升高，與腎功能穩(wěn)定組相比，其差

7、別具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0018)。(2)在急性排斥組，CD4+CD25+Foxp3-T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例均增加，明顯高于腎功能穩(wěn)定組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而腎功能穩(wěn)定組CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例明顯低于正常對(duì)照組，其差別具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0002)。
　　結(jié)論：結(jié)果表明，長(zhǎng)期服用免疫抑制藥物使腎移植受者外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例降低，急性排斥

8、時(shí)高表達(dá)CD25分子和表達(dá)Fxop3分子的細(xì)胞均增多。因此，臨床上可以參考受者外周血中Treg比例的變化來調(diào)整免疫抑制藥物和早期發(fā)現(xiàn)移植排斥。
　　第二部分 腎功能穩(wěn)定及急性排斥受者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞三個(gè)亞群比例變化
　　目的：本部分通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎移植受者外周血中Treg細(xì)胞三個(gè)亞群(如：rTreg、aTreg、cytokine-secreting Treg)的比例，結(jié)合受者的腎功能穩(wěn)定狀態(tài)和急性排斥狀態(tài)，與正常人群

9、進(jìn)行比較，觀察腎移植術(shù)后不同Treg三個(gè)亞群的變化規(guī)律。
　　方法：本研究應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了2008年-2010年2月于我院行腎移植手術(shù)的44例受者外周血中Treg三個(gè)亞群的比例，結(jié)合患者血清肌酐變化情況及移植腎穿刺活檢病理，將其分為腎功能穩(wěn)定組和發(fā)生急性排斥組，并與20例健康志愿者作為對(duì)照，分別觀察Treg三個(gè)亞群在各組間的變化規(guī)律。
　　結(jié)果：(1)與正常對(duì)照組相比，以CD4+CD45RA+Foxp3-為特征的初始T

10、細(xì)胞亞型在急性排斥組外周血中比例明顯降低(P=0.033)，甚至比腎功能穩(wěn)定組還低(P=0.0045)；以CD4+CD45RA-Foxp3-為特征的效應(yīng)性T細(xì)胞亞型在急性排斥組比例升高，與腎功能穩(wěn)定組相比，兩組間的差別具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0010)，與正常對(duì)照組相比，差別也具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0037)。
　　(2)rTreg細(xì)胞比例在急性排斥組的比例明顯高于腎功能穩(wěn)定組，其區(qū)別具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0

11、084)；而aTreg在腎功能穩(wěn)定組和急性排斥組均明顯低于正常對(duì)照組，差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0007和P=0.0189)。(3)統(tǒng)計(jì)cytokine-secreting Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，我們發(fā)現(xiàn)無論正常對(duì)照組，腎移植術(shù)后腎功能穩(wěn)定組還是發(fā)生急性排斥組，該群細(xì)胞比例相當(dāng)，兩兩間的差異均沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：發(fā)生急性排斥時(shí)，初始型T細(xì)胞向活化型Teff轉(zhuǎn)化，提示機(jī)體在對(duì)同種異型抗原發(fā)生應(yīng)答時(shí)，活

12、化了初始型T細(xì)胞而不是使其胸腺輸出Teff增多。腎移植術(shù)后，免疫抑制藥物主要使aTreg的比例減少，對(duì)rTreg和cytokine-secretingTreg的影響不明顯。急性排斥發(fā)生時(shí)rTreg的胸腺輸出增多，而rTreg向aTreg的轉(zhuǎn)化未見明顯變化，提示我們急性排斥時(shí)機(jī)體通過增加胸腺輸出rTreg來控制免疫應(yīng)答。因此，免疫抑制藥物的使用對(duì)Treg各亞型的影響并不一致，受者不同免疫狀態(tài)其外周血中Treg亞型也存在差異，提示我們檢Tr

13、eg亞型可能給指導(dǎo)臨床個(gè)體化應(yīng)用免疫抑制藥物和早期發(fā)現(xiàn)移植排斥提供幫助。
　　第三部分 造血干細(xì)胞移植聯(lián)合腎移植受者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其亞群變化
　　目的：本部分通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植受者外周血中Treg細(xì)胞及其亞群(如：rTreg、aTreg、cytokine-secreting Treg)的比例，與單純腎移植受者進(jìn)行比較，觀察造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植受者外周血中不同Treg及其亞群的變化規(guī)律，初步推測(cè)Tr

14、eg及其亞群在誘導(dǎo)免疫耐受中的作用。
　　方法：本研究應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了2009年于我院行造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植手術(shù)的2例受者外周血中Treg及其亞群的比例，并與單純腎移植受者相比較，別觀察了Teff兩亞群和Treg及其三個(gè)亞群的變化規(guī)律，對(duì)該兩例患者進(jìn)行病例分析。
　　結(jié)果：與單純腎移植方案受者比較，造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植受者外周血中初始型CD4+CD45RA+Foxp3-T細(xì)胞在同種異型抗原的刺激下大量活化為CD4+CD

15、45RA-Foxp3-效應(yīng)性T細(xì)胞；在腎移植術(shù)后早期，造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植受者外周血中rTreg大量活化為aTreg，從而出現(xiàn)術(shù)后早期aTreg的急劇升高，但cytokine-secreting Treg沒有明顯變化。
　　結(jié)論：造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植受者外周血中Treg及其亞型變化與單純腎移植受者有較大的不同。首先，造血干細(xì)胞移植后，受者外周血中淋巴細(xì)胞短時(shí)間受到大量同種異型抗原的刺激，活化較為明顯，術(shù)后早期耗竭了大量同種異型抗原

16、反應(yīng)性細(xì)胞克隆，對(duì)誘導(dǎo)免疫耐受有幫助。其次，受者在術(shù)前預(yù)處理的基礎(chǔ)上，接受大量同種異型抗原刺激后外周血中aTreg亞型比例明顯增高，從而抑制效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)移植物過強(qiáng)的免疫應(yīng)答，這可能是該方案能誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制之一。再次，造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植受者外周血中，rTreg早期比例下降，而兩周后其比例逐漸恢復(fù)，并在后期其比例上升，提示造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植受者外周血中胸腺輸出的rTreg增多。因此，我們推測(cè)造血干細(xì)胞聯(lián)合腎移植能誘導(dǎo)免疫耐受可能與