二穗短柄草Ds轉(zhuǎn)座群體的構(gòu)建與利用.pdf

1、二穗短柄草是一種新興的溫帶禾本科模式植物，對食品、牧草和能源等相關(guān)領(lǐng)域的研究具有重要的價(jià)值。二穗短柄草同擬南芥一樣具有諸多優(yōu)點(diǎn):基因組小、植株小、生長周期短、自花授粉、易轉(zhuǎn)化等。在最近幾年，有關(guān)二穗短柄草的研究取得了飛速的發(fā)展，主要依賴兩個(gè)方面，一是二穗短柄草Bd21全基因組測序的完成，二是二穗短柄草農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破。
　　 研究基因的功能，首先要獲得相關(guān)突變體材料。目前擬南芥和水稻基本實(shí)現(xiàn)了全基因組的飽和插入突變，而二

2、穗短柄草突變體材料的收集工作還處在起步階段。二穗短柄草突變體材料主要通過兩條途徑獲得:第一條途徑是化學(xué)誘變（如EMS誘變）;第二條途徑是T-DNA插入突變，預(yù)期2013年二穗短柄草T-DNA插入突變總數(shù)量達(dá)到5萬份，而二穗短柄草實(shí)現(xiàn)飽和突變至少需要20萬份。這兩種誘變方式各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，化學(xué)誘變前期工作量小，可以快速的獲得大量突變體，但是后期定位到相關(guān)基因比較困難，需要花費(fèi)大量的時(shí)間。而T-DNA插入突變正好相反，前期需要花費(fèi)大量的勞動(dòng)

3、力和資金，但是在后續(xù)階段可以非常方便地定位到T-DNA插入位置，獲得相關(guān)基因的信息。考慮到節(jié)省時(shí)間、勞動(dòng)力、資金以及高效等方面的因素，本論文主要涉及二穗短柄草Ds轉(zhuǎn)座群體的構(gòu)建與分析。
　　 Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)目前在擬南芥、煙草和水稻等植物中廣泛應(yīng)用。Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的特點(diǎn)是:偏向于插入到含基因區(qū)域，轉(zhuǎn)座距離相對較近，轉(zhuǎn)座后往往在原位點(diǎn)留下8bp的重復(fù)序列即足跡。理論上只要有Ac-TPase的存在，Ds就存在一定概率發(fā)生跳躍，

4、會(huì)導(dǎo)致原來的Ds插入不穩(wěn)定。為克服Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的缺點(diǎn)，本篇論文使用了2個(gè)誘導(dǎo)型Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng):乙醇誘導(dǎo)型Ds系統(tǒng)(pHL1)，地塞米松誘導(dǎo)型Ds系統(tǒng)(pHL2)。pHL1在外源施加乙醇的條件下，能夠產(chǎn)生AcTPase，促使Ds跳躍，產(chǎn)生新的插入突變。pHL2載體Ac-TPase與GR屬于融合蛋白，在外源添加地塞米松的條件下，融合蛋白能夠進(jìn)入到細(xì)胞核，促使Ds跳躍，產(chǎn)生新的插入突變。通過誘導(dǎo)系統(tǒng)，既能保證Ds的穩(wěn)定，又能調(diào)控Ds跳躍。

5、
　　 本研究的目的是，通過構(gòu)建高密度的T-DNA群體，在外源添加誘導(dǎo)劑的情況下，誘使Ds跳躍，快速地獲得大量新的插入突變，實(shí)現(xiàn)二穗短柄草全基因組飽和突變;同時(shí)利用Ds轉(zhuǎn)座的特點(diǎn)，對Ds附近的基因?qū)崿F(xiàn)定向插入失活。
　　 目前大約獲得了1000份pHL1、p-HL2和組成型Ac/Ds T-DNA系。對pHL1用乙醇誘導(dǎo)后，能夠檢測到Ac-TPase表達(dá)量顯著上升，部分植株最高表達(dá)量上升200倍以上。同時(shí)對pHL1不同植株

6、間的Ac-TPase本底水平進(jìn)行分析，不同植株之間表現(xiàn)不同差異。通過PCR檢測的方式對誘導(dǎo)過后的pHL1植株Ds瞬時(shí)跳躍進(jìn)行鑒定，挑選13個(gè)株系，檢測到3個(gè)株系Ds發(fā)生跳躍;pHL2用地塞米松誘處理后，從10個(gè)株系檢測到8個(gè)株系Ds發(fā)生跳躍;組成型Ac/Ds系統(tǒng)，半定量檢測到Ac-TPase的表達(dá)，同時(shí)在檢測的10個(gè)株系中檢測到9個(gè)株系Ds發(fā)生跳躍。同時(shí)對pHL1、 pHL2和組成型Ac/Ds系統(tǒng)Ds跳躍后獲得的31個(gè)測序結(jié)果分析，結(jié)果

7、表明Ds跳躍后會(huì)從原來插入位置帶走部分堿基，或者插入部分堿基。
　　 構(gòu)建T-DNA高密度插入群體的過程中，獲得了一份油菜素內(nèi)酯合成缺失體材料，通過T-DNA定位和進(jìn)化樹分析，定位到一個(gè)brassinosteroid C6-oxidase基因。利用brassinosteroid C6-oxidase基因組全長進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)，互補(bǔ)后的植株恢復(fù)到野生型。對純合子材料外源添加BR，能夠部分恢復(fù)到野生型，進(jìn)一步證實(shí)該基因與油菜素內(nèi)酯的合成