副干酪乳桿菌生物膜反應器構(gòu)建及其L-乳酸生產(chǎn)應用研究.pdf

1、L-乳酸是一種重要的有機酸，在食品中主要用作防腐劑或酸味劑等。隨著科技和生活水平的不斷提高，乳酸及其衍生物的用途不斷擴展。其中，最引人注目的應用在于合成可生物降解材料—聚乳酸。近年來聚乳酸的出現(xiàn)引領(lǐng)了乳酸消費的新興領(lǐng)域，致使市場對高光學純度的L-乳酸需求旺盛。與傳統(tǒng)的乳酸生產(chǎn)方法相比，生物膜法因其可簡化固定化過程、提高細菌密度、且膜內(nèi)細菌有著更強的耐受力等優(yōu)勢，被認為是一種最具潛力的乳酸工業(yè)化生產(chǎn)工具。
　　纖維膜具有高比表面積和

2、高孔隙率的結(jié)構(gòu)，利于細菌附著，能為細菌提供理想的生存和繁殖的立體空間，是一種理想的生物膜載體。副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei，LPA)廣泛存在于人體腸道及傳統(tǒng)的乳酪制品中，是發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的良好菌種。本課題以副干酪乳桿菌在醋酸纖維素納米纖維膜(Cellulose acetate nanofibermembrane，NCA)表面形成的乳酸菌生物膜為對象，構(gòu)建乳酸菌生物膜反應器，對其培養(yǎng)條件、菌體活性、穩(wěn)定性

3、及抗逆性進行探究，最后初步評定其產(chǎn)酸性能。具體研究工作主要圍繞以下幾個方面展開:
　　1.副干酪乳桿菌生物膜的調(diào)控
　　通過比較副干酪乳桿菌在不同纖維膜材料上形成的生物膜，優(yōu)選出乳酸菌生物膜形成的最佳載體，醋酸纖維素納米纖維膜;探究了培養(yǎng)時間、接種量及營養(yǎng)物質(zhì)對醋酸纖維素納米纖維膜表面乳酸菌生物膜形成的影響。結(jié)果顯示，生物膜在培養(yǎng)至第三天時，其菌體干重最高，隨著時間的延長，生物膜干重處于穩(wěn)定狀態(tài);接種量對生物膜干重無較大的影

4、響;蔗糖和Mg2+對醋酸纖維素納米纖維膜表面生物膜的形成有一定的促進作用。
　　2、副干酪乳桿菌生物膜結(jié)構(gòu)與生理特性
　　通過多種表征手段對副干酪乳桿菌生物膜的物理化學結(jié)構(gòu)進行表征，其中，采用活菌計數(shù)和激光共聚焦顯微鏡分析方法，對副干酪乳桿菌生物膜內(nèi)總活菌數(shù)和不同層面的活菌率進行研究;采用化學法對胞外聚合物中多糖和蛋白質(zhì)隨時間的變化規(guī)律進行定量分析。結(jié)果顯示，本實驗培養(yǎng)的乳酸菌生物膜具有典型的生物膜形態(tài)和結(jié)構(gòu);隨著培養(yǎng)時間的

5、增加，生物膜內(nèi)活菌數(shù)雖有下降，但仍維持1012 CFU/g，生物膜底層活菌率普遍低于其內(nèi)層和表層，但綜合生物膜每層平均活菌率始終維持在80％以上;胞外聚合物中多糖和蛋白質(zhì)的含量均隨著生物膜培養(yǎng)時間的增加而增加，其中蛋白質(zhì)的含量始終高于多糖。
　　3、副干酪乳桿菌生物膜的穩(wěn)定性及抗逆性
　　通過振蕩和超聲法對醋酸纖維素納米纖維膜表面的乳酸菌生物膜進行處理，考察生物膜在材料上的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。采用熱處理、酸堿處理和抗生素

6、處理，考察生物膜的抗逆性。實驗結(jié)果表明，在醋酸纖維素納米纖維膜上形成的生物膜具有較強的穩(wěn)定性，同時還具有極強的抗逆特性，在50℃、100℃、200℃、pH1.2、pH2、pH10以及0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL三種不同抗生素濃度條件下，均表現(xiàn)出比懸浮狀態(tài)更強的耐受力，從一定角度證明了本實驗中乳酸菌生物膜具有較強對于不良環(huán)境的抵抗能力?；诖私Y(jié)果，采用轉(zhuǎn)錄組測序法對副干酪乳桿菌生物膜細胞及其懸浮細胞的基

7、因進行表達差異分析。結(jié)果顯示，副干酪乳桿菌生物膜細胞基因表達模式不同于懸浮細胞，差異基因中的整合酶、多要轉(zhuǎn)運蛋白、細胞分裂蛋白、β-內(nèi)酰胺水解酶在副干酪乳桿菌生物膜成熟及抗藥性作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　4、副干酪乳桿菌生物膜反應器發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
　　首先通過搖瓶發(fā)酵，對副干酪乳桿菌在醋酸纖維素納米纖維膜上形成的生物膜和懸浮菌的產(chǎn)酸能力進行對比;再通過構(gòu)建乳酸菌生物膜反應器，考察初始葡萄糖濃度、發(fā)酵液pH及流速對副干酪乳桿菌

8、生物膜生產(chǎn)L-乳酸性能的影響規(guī)律，并對其長期發(fā)酵穩(wěn)定進行評價。結(jié)果顯示，生物膜發(fā)酵過程中沒有延滯期，產(chǎn)酸效率普遍高于懸浮菌;且當初始葡萄糖濃度為80 g/L、pH為6.5、流速為0.3 L/h時，其L-乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化效率最高;在30天共9批發(fā)酵過程中，前7批的L-乳酸平均轉(zhuǎn)化率在75％以上，從第8批開始反應器生產(chǎn)效率略微有所下降。這說明所構(gòu)建的副干酪乳桿菌生物膜反應器不僅具有較好的L-乳酸發(fā)酵性能，而且生產(chǎn)穩(wěn)定。這一結(jié)果為高密度連續(xù)發(fā)酵