抗腫瘤天然產(chǎn)物CC-1065和YM-216391生物合成相關(guān)基因功能研究.pdf

1、CC-1065是1978年由美國Upjohn公司發(fā)現(xiàn)的，它是由鏈霉菌Streptomyces ZelensvsNRRL11183發(fā)酵培養(yǎng)基中分離出的一類具有抗真菌和高抗腫瘤活性的的微生物次級代謝產(chǎn)物。它與已發(fā)現(xiàn)的Yatakemycin，DuocarmycinA，DuocarmycinSA等屬于同一家族，這類家族的骨架部分是由吲哚與兩個吡咯吲哚環(huán)通過兩個酰胺鍵連接組成。CC-1065分子中藥效基團---環(huán)丙烷苯并二吡咯亞基對細(xì)胞的有絲分裂

2、期G2期和M期起作用，其作用機制是直接與DNA共價結(jié)合，形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這樣穩(wěn)定的DNA結(jié)構(gòu)很難被解旋，從而難以復(fù)制DNA，起到強大的抑制腫瘤細(xì)胞繁殖的能力。
　　 雖然CC-1065有較強的抗腫瘤活性，但是其水溶性較差，對肝腎也有比較大的毒性，在臨床應(yīng)用受到了限制，所以我們希望了解其生物合成機制來進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，從而研制出毒性較小，藥性更強的新型化合物。
　　 在本課題組蹇曉紅博士克隆得到的完整的CC-1065基因簇

3、的基礎(chǔ)上，對基因簇進(jìn)行詳細(xì)的序列分析，整個基因簇共包含38.626kb，29個ORF。另外我們推測每個基因最有可能的功能及其在CC-1065生物合成中所起的作用，進(jìn)而對CC-1065的生物合成機制提出合理假設(shè)。
　　 本工作主要研究重點是CC-1065基因簇中的10個基因的功能分析。通過基因敲除，我們發(fā)現(xiàn)其中c10V，c10K,c10E,c10S,c100這5基因突變株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC檢測顯示中斷了CC-1065的產(chǎn)生，c10W

4、，c10D,c10R6這3個基因突變株的發(fā)酵結(jié)果顯示未中斷CC-1065的產(chǎn)生。還有在抗性基因c10R5的敲除和回補實驗中，我們發(fā)現(xiàn)缺失突變株ΔR5較野生型減少了17％，回補突變株ΔR5-回補較野生型增加了5％，我們推測這與抗性基因自我保護機制有關(guān)。另外在c10A敲除實驗中，發(fā)現(xiàn)有一個m/z=432(M+NH4)新化合物的積累，這個新化合物的分離鑒定將有可能揭示CC-1065部分生物合成機制。這些基因功能的初步研究為下一步揭示CC-10

5、65的生物合成途徑打下了基礎(chǔ)。同時為以后的相關(guān)酶催化研究創(chuàng)造了有力的開局。
　　 我們課題組另外對具有代表性的環(huán)肽YM-216391進(jìn)行了初步研究。環(huán)肽YM-216391是含多惡唑-噻唑環(huán)的大環(huán)天然產(chǎn)物，具有良好的抗腫瘤活性。此前實驗室已經(jīng)克隆得到其生物合成基因簇，為了探討環(huán)肽YM-216391的異源合成，本研究將包含YM-216391合成整個基因簇的粘粒導(dǎo)入不同的鏈霉菌中，結(jié)果顯示，YM-216391在幾個不同的鏈霉菌宿主中都