miR-449a通過靶定Bcl2調(diào)節(jié)自噬影響矽塵誘導的肺纖維化.pdf

1、矽肺病(Silicosis)是在生產(chǎn)過程中長期吸入含較高濃度游離二氧化硅(SiO2)粉塵所導致的以肺部組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病，在煤碳、冶金、鐵道及建材等工業(yè)行業(yè)中發(fā)病率較高，是我國最嚴重的職業(yè)病之一。大量研究表明矽肺纖維化的重要病理特征為成纖維細胞過度增殖，成纖維細胞向肌成纖維細胞分化以及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度沉積。矽肺的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前無特效治療方法，因此探明矽肺的發(fā)病

2、機制，對于研究有效的矽肺預(yù)防、診斷和治療方法十分重要。近年來有研究表明，細胞自噬與microRNA(miRNA)在肺纖維化發(fā)生過程中均發(fā)揮重要的作用。
　　自噬作為細胞經(jīng)典的能量代謝和自我更新機制，在生物發(fā)育過程以及維持機體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。自噬發(fā)生標志是雙層膜自噬小體的形成，將胞質(zhì)內(nèi)衰老的細胞器、蛋白質(zhì)和生物大分子等包裹，再與溶酶體融合形成單層膜的自噬溶酶體，溶酶體酶對其中的包裹物質(zhì)進行降解，為細胞及細胞器的重構(gòu)、再生與修復

3、提供原料，實現(xiàn)細胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)與再利用。越來越多的證據(jù)表明，自噬在許多人類疾病中發(fā)揮復雜的調(diào)控作用。其中miRNA通過靶定重要的自噬相關(guān)基因，對自噬的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要的作用。
　　miRNA作為一種長度在18-22個堿基的非編碼小RNA，通過與其靶基因mRNA的3'UTR區(qū)完全或部分互補結(jié)合，降解靶mRNA或抑制其翻譯。已有研究表明，miRNA可通過抑制自噬相關(guān)基因的表達從而調(diào)節(jié)細胞自噬水平，參與許多疾病如癌癥、神經(jīng)退行性病變等疾病的

4、發(fā)生發(fā)展。
　　目的:
　　(1)建立矽塵誘導小鼠肺纖維化模型，對小鼠肺組織中自噬活性與miR-449a水平進行檢測，在成纖維細胞模型中進行驗證。明確自噬活性在矽塵誘導小鼠肺纖維化組織中的變化。
　　(2)使用miR-449a mimic與轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1處理成纖維細胞，同時使用agomiR-449a處理矽肺動物模型，來進一步證明miR-449a與自噬活

5、性在矽塵誘導肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。
　　(3)結(jié)合相關(guān)文獻報道及生物信息學網(wǎng)站分析，預(yù)測miR-449a作用的自噬相關(guān)靶基因，并對其進行驗證。期望從自噬和miRNA的角度揭示矽肺的部分發(fā)病機制，最終為矽肺的預(yù)防、早期診斷與治療提供線索。
　　方法:
　　(1)矽塵誘導的小鼠矽肺模型的建立:暴露氣管，一次性直接灌注SiO2粉塵懸液的方式建立小鼠肺纖維化模型，通過不同時間點(0、7、14、28天)肺組織病理切片HE

6、染色觀察SiO2粉塵誘導小鼠矽肺發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化過程。
　　(2)使用qRT-PCR檢測矽塵處理不同時間點小鼠肺組織中miR-449a的表達改變，Western Blots檢測自噬標志物LC3與p62的改變情況。
　　(3)使用TGF-β1處理成纖維細胞構(gòu)建肺纖維化體外模型，qRT-PCR檢測miR-449a的表達改變，使用Western Blot檢測自噬標志物LC3與p62的蛋白表達情況。
　　(4)使用agomi

7、R-449a聯(lián)合矽塵構(gòu)建矽肺小鼠模型，病理切片HE染色觀察小鼠肺組織的纖維化程度，qRT-PCR檢測miR-449a的表達改變，使用Western Blot檢測自噬標志物LC3與p62的蛋白表達情況。使用miR-449a mimic轉(zhuǎn)染聯(lián)合TGF-β1處理NIH-3T3與MRC-5細胞，使用Western Blot檢測自噬標志物LC3與p62的蛋白表達情況，免疫熒光檢測p62的表達，轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒檢測自噬活性，同時使用透射電鏡觀

8、察NIH-3T3細胞中自噬小體數(shù)目的改變情況。
　　(5)進一步通過查閱文獻并結(jié)合miRDB、TargetScan、PicTar、DIANA-microT等生物信息學軟件找出miR-449a的自制相關(guān)的靶基因Bcl2，并使用Western Blot和熒光素酶報告基因的方法進行驗證。(6)Western Blot檢測TGF-β1處理后，Western Blot檢測ERK1/2的磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠矽肺組

9、織中miR-449a表達下降，自噬活性受到抑制:病理切片HE染色顯示，在SiO2粉塵處理的第7天，即可見肺泡內(nèi)有明顯的炎性細胞聚集，第28天時可見大量的蔥皮樣矽結(jié)節(jié)存在，肺組織廣泛纖維化。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)0、7、14、28天小鼠肺組織中miR-449a的水平逐漸下降。使用Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)0、7、14、28天小鼠肺組織中上皮標志物E-Cadherin表達逐漸下降，Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌動蛋白(α

10、-SMA)、纖連蛋白（fibronectin）、波形蛋白(vimentin)、p62的表達逐漸增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值逐漸下降。說明隨著矽肺的發(fā)生發(fā)展，小鼠肺組織中miR-449a的表達及自噬活性均受到抑制。
　　2.TGF-β1可抑制成纖維細胞自噬活性及miR-449a的表達:使用不同濃度(0、1、2、5ng/ml) TGF-β1處理小鼠胚胎成纖維細胞系(NIH-3T3)和人正常胚肺成纖維細胞系(MRC-5)處理24小時，

11、或使用2ng/ml TGF-β1處理NIH-3T3和MRC-5細胞系不同時間（0、12、24、48小時），發(fā)現(xiàn)vimentin、fibronectin和p62的表達水平隨著TGF-β1處理的濃度和時間而逐漸增加，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值則逐漸下降。使用2ng/ml TGF-β1處理兩種細胞系48小時后，用qRT-PCR檢測miR-449a的水平較對照組顯著下降。說明使用TGF-β1構(gòu)造的肺纖維化體外模型中，自噬活性與miR-449a的

12、水平與體內(nèi)試驗的結(jié)果一致，均受到抑制。
　　3.高表達miR-449a可抑制SiO2誘導的小鼠肺纖維化:在矽肺模型中觀察到，高表達miR-449a組小鼠肺組織病理切片與單純SiO2處理組相比，肺纖維化評分明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。肺組織中的CollagenⅠ、α-SMA、fibronectin和vimentin較單純SiO2處理組相比顯著下降。自噬標志物p62的表達下降，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值上升。提示miR-449a能顯

13、著降低肺纖維化的程度，其機制可能與自噬有關(guān)。
　　4.miR-449a能增加成纖維細胞的自噬活性:體外實驗的結(jié)果顯示，高表達miR-449a之后，NIH-3T3與MRC-5的CollagenⅠ、α-SMA、fibronectin與vimentin的表達均下降，自噬標志物p62的表達下降，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值上升。免疫熒光結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-449a后p62的表達下降。轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)，高表達miR-449a后NI

14、H-3T3細胞中綠色熒光斑點數(shù)目增加，表示細胞自噬活性增加。激光共聚焦實驗結(jié)果顯示，高表達miR-449a后NIH-3T3細胞內(nèi)自噬小體的數(shù)目顯著增加。這些均提示miR-449a能增加成纖維細胞的自噬活性。
　　5.miR-449a通過靶向作用于Bcl2增加細胞自噬:應(yīng)用多種生物學軟件預(yù)測miR-449a作用的靶基因，發(fā)現(xiàn)在Bcl2的3'UTR區(qū)存在miR-449a種子序列的結(jié)合位點，提示Bcl2可能是miR-449a的靶基因。進

15、一步用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬眚炞C，轉(zhuǎn)染miR-449a后，NIH-3T3細胞的Bcl2蛋白水平下降，顯示同時轉(zhuǎn)染miR-449amimic與Bcl2野生型質(zhì)粒后，熒光活性較同時轉(zhuǎn)染miR-449a mimic與Bcl2突變型質(zhì)粒相比顯著下降。提示Bcl2是miR-449a的靶基因。
　　6.TGF-β1通過ERK信號通路抑制Bcl2的降解: Bcl2的蛋白水平隨著TGF-β1處理的濃度和時間的增加而逐漸增加。Western bl

16、ot實驗結(jié)果顯示，ERK1/2的磷酸化水平也隨著TGF-β1處理的濃度和時間的增加而逐漸增加，提示TGF-β1通過ERK1/2信號通路抑制了Bcl2的降解，從而使得細胞的自噬水平受到抑制。
　　結(jié)論:
　　在SiO2誘導的小鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-449a隨著肺纖維化的發(fā)展而逐漸下降，同時自噬活性受到抑制。高表達miR-449a后，小鼠的肺纖維化受到抑制，同時肺組織細胞自噬活性增加，使用TGF-β1處理成纖維細胞