水稻調(diào)節(jié)銨吸收基因篩選及擬南芥銨吸收調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、氮是植物重要的營養(yǎng)元素，約占其干重的2％，并且與作物生產(chǎn)聯(lián)系密切。硝酸和銨根離子是高等植物主要的氮營養(yǎng)源。植物可通過根系中的銨運輸?shù)鞍祝ˋmmonium transporters, AMTs）從土壤中直接吸收銨離子，或者通過還原土壤中吸收的原硝酸根離子在體內(nèi)積累銨。本研究以水稻和擬南芥為試驗材料，圍繞銨耐性水稻的銨吸收和代謝基因篩選、銨敏感性擬南芥的銨吸收調(diào)節(jié)機制進行試驗研究和分析，得出以下主要結(jié)果：
　　1.調(diào)節(jié)水稻銨吸收和代謝

2、基因的篩選
　　根據(jù)文獻報道，高濃度銨會讓水稻等作物主根的根尖卷曲，因此本研究把銨對水稻幼苗期根生長的抑制作用定為篩選指標。利用一組含有玉米轉(zhuǎn)座子 Ac（Activator）/Ds（Dissociation）的水稻種子，通過愈傷組織培養(yǎng)再分化系統(tǒng)，共獲得600多個突變體。在此突變體庫中共篩選出了7個對高濃度銨敏感的突變體。再通過根表型穩(wěn)定性測試，檢測 F2代水稻植株中有根尖卷曲表型植株的比例是否吻合孟德爾遺傳中3:1的分離規(guī)律。經(jīng)

3、過檢測，我們發(fā)現(xiàn)共有3個突變體吻合孟德爾遺傳規(guī)律，其Ds插入位點與調(diào)節(jié)水稻銨吸收和代謝有關(guān)。
　　針對其中的m1突變體，利用反向PCR（iPCR）和測序技術(shù)鑒定，得出在m1突變體中Ds插入在谷氨酰胺合成酶1;2（GS1;2，Os03g0223400）基因的第二個內(nèi)含子中，是一個水稻中與銨吸收和代謝有關(guān)的基因；此基因含11個外顯子和10個內(nèi)含子。本實驗結(jié)果對于銨代謝與水稻等作物根系發(fā)育研究具有參考價值。
　　2.擬南芥油菜素內(nèi)

4、酯（Brassinosteroid, BR）信號對銨吸收的影響
　　本研究發(fā)現(xiàn)BR信號通路的激活可負調(diào)控銨轉(zhuǎn)運蛋白基因AMT1和谷氨酰氨合成酶和谷氨酸合成酶基因（GS/GOGAT）的表達。前人已初步探索了NH4+介導(dǎo)的AMT1基因表達抑制機理是氮的代謝物而不是 NH4+影響 AMT1基因的轉(zhuǎn)錄。BES1（BRI1-EMS-suppressor1）是BR信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，本實驗顯示BES1功能增效突變體（bes1-D）能部分

5、抑制NH4+介導(dǎo)的GS/GOGAT基因表達。NH4+的再補充能抑制AMT1基因的表達，但NH4+介導(dǎo)的AMT1基因表達抑制在bes1-D中被制止。在野生型（En2）和 bes1-D中，經(jīng)谷氨酰胺處理，AMT1基因的表達得到抑制，提示 BES1可能是通過抑制NH4+介導(dǎo)的GS/GOGAT基因表達，從而制止bes1-D中AMT1基因表達的抑制。
　　3.擬南芥中光受體和油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)之間相互關(guān)系
　　光對植物的生長和發(fā)育至關(guān)

6、重要，光被光受體識別。前期研究中報道，擬南芥AMT1的表達水平在白天要高于黑夜。而BR激素調(diào)節(jié)著植物生長和發(fā)育的多個方面，包括光形態(tài)發(fā)生、光和BR信號之間相互作用。因此，本研究探討了光受體和AMT1及BR表達之間的關(guān)系。
　?。?）光受體對AMT1表達的影響：phyB9（far-red light receptor mutant），phyA211/phyB9（red and far-red light receptor doubl

7、e mutant）和 phot1-2/cry1-2（blue light receptor quadruple mutant）突變體中 AMT1;1基因的表達顯著高于野生型；phyA211（red light receptor mutant），phot1-2和cry1-2（blue light receptor double mutant）突變體中AMT1;1基因的表達較野生型無顯著性變化。
　?。?）光受體和BR信號之間的關(guān)系：

8、cop1-4（constitutive photomorphogenic1 mutant）和HY5 ox（long hypocotyl5 overexpression mutant）突變體在暗條件下對BR的不同反應(yīng)，提示在暗條件下，BR促進cop1-4突變體下胚軸伸長源于COP1和BZR1的相互作用，而不是通過HY5的過表達。光受體突變體對BR的反應(yīng)顯示phyA211，phyA211/phyB9和phot1-2/cry1-2對外源性的B

9、R不敏感。
　　為了進一步分析BR對光受體突變體的作用，本研究應(yīng)用了BR生物合成抑制劑丙環(huán)唑（PCZ）。在100 nM PCZ條件下，cry1-2和phot1-2/cry1-2突變體對PCZ不敏感， phyB9和phyA211/phyB9突變體對PCZ敏感性較低。但在光照條件下，高濃度的PCZ（1μM）完全抑制了 cry1-2和 phot1-2/cry1-2突變體下胚軸的伸長，表明 cry1-2和phot1-2/cry1-2突變體

10、下胚軸的伸長需要BR活性。通過分析光受體突變體中BR標記基因表達水平，顯示不同的光受體突變體對BR生物合成和信號基因的調(diào)節(jié)不同，表明光受體在一定程度上調(diào)節(jié)BR信號通路。未經(jīng)PCZ處理，在phot1-2/cry1-2突變體中BR標記基因的表達與bzr1-D突變體相似；但經(jīng)過PCZ處理，在phot1-2/cry1-2突變體中， SAUR15和ACS5基因的表達完全被抑制。而在bzr1-D中，PCZ沒有完全抑制SAUR15和ACS5基因的表達

11、。以上數(shù)據(jù)顯示光受體負調(diào)控BR信號。相反，在bri1-5和bzr1-D突變體中光受體的表達顯示BR信號在轉(zhuǎn)錄水平上負調(diào)控光受體。
　　4.擬南芥AtBS14b過表達對油菜素內(nèi)酯信號的影響
　　AtBS14b作為一種SNARE蛋白（N-ethyl-maleimide sensitive factor adaptor protein receptor），在銨刺激后其轉(zhuǎn)錄水平具有明顯的上調(diào)趨勢。但在擬南芥中過表達 AtBS14b的

12、發(fā)現(xiàn)，過表達植物的下胚軸和葉柄明顯比對照組短。大量前期研究報道，下胚軸和葉柄細胞的延伸受激素的調(diào)控，如油菜素內(nèi)脂（BR）和赤霉素（Gibberellic acid, GA）。在本研究中，AtBS14b ox植株對外源性的 BR不敏感，另外，BR介導(dǎo)的生物合成基因（BR6OX2, CPD和DWF4）抑制在AtBS14b ox中被制止。同時，Split GFP和酵母雙雜交實驗顯示，AtBS14b是與MSBP1作用，而不是與BRI1或BAK1