細菌纖維素(BC)基關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)支架材料的制備及評價.pdf

1、木醋桿菌（A.xylinum）分泌的細菌纖維素（BC）是目前組織工程應(yīng)用中最具前景的天然材料之一。因其獨特的纖維素成分及其三維納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以水凝膠形式存在的BC被賦予了多種優(yōu)良的性能，如高力學(xué)強度、高吸水和保水性、高比表面積、微觀或宏觀結(jié)構(gòu)可塑性、生物相容性以及生物可降解性等。通過與臨床應(yīng)用所需的關(guān)節(jié)軟骨支架材料對比，BC顯示出極為符合的特性，已被研究者廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)領(lǐng)域。然而，BC單一的纖維素成分和致密的三維納米纖維

2、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而引起的生物活性低和細胞難以滲入的缺點，限制了BC在該領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。盡管國內(nèi)外已有許多關(guān)于BC基支架材料表面理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)改性的報道，但設(shè)計的工藝方法仍無法實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，且開發(fā)的產(chǎn)品性能未能滿足臨床應(yīng)用的要求。因此，今后的研究重點為調(diào)控BC表面組成成分和三維微觀結(jié)構(gòu)，以開發(fā)臨床應(yīng)用關(guān)節(jié)軟骨支架材料為目標，建立和完善改性BC基支架材料的工藝路線和體外細胞評價體系。
　　因此，本論文針對現(xiàn)有BC基關(guān)節(jié)軟骨支架材料在表面

3、理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的改性技術(shù)和產(chǎn)品上所存在的問題采取以下解決方法：
　?。?）將A.xylinum接種于糊化藕粉（LRS）發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用簡易的生物合成法制備了BC/LRS復(fù)合支架材料，改善了BC作為關(guān)節(jié)軟骨支架材料的生物相容性。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的可以提高BC的產(chǎn)率，促進密集纖維絲束在復(fù)合支架材料的形成。隨著濃度逐漸上升，糊化藕粉反而降低BC的產(chǎn)率，同時改變復(fù)合支架材料的微觀形態(tài)，并產(chǎn)生層狀纖維結(jié)構(gòu)。通過XRD、熱重以及力學(xué)性能

4、測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糊化藕粉的添加對BC/LRS復(fù)合支架材料的結(jié)晶度、熱穩(wěn)定性以及力學(xué)性能產(chǎn)生顯著的影響。通過體外細胞Live/Dead分析結(jié)果表明，BC/LRS復(fù)合支架材料具有較高的細胞活性值，意味著藕粉的存在促進了BC基支架材料的細胞生物相容性。而與其他BC/淀粉復(fù)合支架材料對比時，可發(fā)現(xiàn)BC/LRS復(fù)合支架材料能夠支撐更多的細胞生長。此外，利用共聚焦顯微鏡還觀察到，經(jīng)過14d的培植后，關(guān)節(jié)軟骨細胞可在BC/LRS復(fù)合支架材料上形成成熟的

5、伸展形態(tài)。這些結(jié)果表明，利用生物合成法制備的BC/LRS復(fù)合支架材料具有可控的物化性能和改良的細胞生物相容性，拓展了BC作為關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)支架材料的應(yīng)用前景。
　　（2）通過在BC表面分別引入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和海藻酸鈉（SA）兩種修飾物質(zhì)，然后利用仿生礦化法制備了BC/羥基磷灰石（BC/HA）復(fù)合支架材料，達到了模擬關(guān)節(jié)軟骨鈣化層的細胞外基質(zhì)（ECM）和縮短BC支架材料礦化時間的目的。結(jié)果表明，PVP和SA因所具有的極性基團

6、對Ca2+產(chǎn)生穩(wěn)定的吸附作用，加速了HA在BC表面的成核，同時縮短了復(fù)合支架材料的礦化時間。而利用PVP修飾BC時，所得到的HA晶體為棒狀形態(tài)。相比之下，經(jīng)SA修飾后，該晶體呈現(xiàn)理想的球形形貌。通過FTIR-ATR圖譜結(jié)果顯示，在BC/HA復(fù)合支架材料上的HA晶體為CO32+離子摻雜型，并類似于人體HA的組成成分。元素分析結(jié)果表明 HA在支架材料上的含量隨著礦化時間的增長而逐漸上升，尤其是在BC-PVP-SBF和BC-SA-SBF復(fù)合支

7、架材料上，其含量值相對較高。同時HA晶體的Ca/P摩爾比處于1.37到1.57之間，表明合成的HA為缺鈣型晶相。通過共聚焦顯微鏡的觀察和堿性磷酸酶活性的測試結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨細胞在BC-SA-SBF支架材料上的能夠最早地顯現(xiàn)成熟的細胞形態(tài)，且具有更好的細胞分化能力。
　?。?）利用新型簡單的表面活性劑輔助偶氮二甲酰胺(AC)發(fā)泡技術(shù)，改造了BC支架材料的致密微孔結(jié)構(gòu)，解決了現(xiàn)有致孔技術(shù)難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的問題。通過借助BC三維網(wǎng)絡(luò)

8、互穿通道，AC以溶解在堿性水溶液的形式，與BC纖維絲束形成均勻粘附。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當利用表面活性劑Tween80輔助AC發(fā)泡時，可在成型的BC支架材料上構(gòu)建均一、連續(xù)的大孔結(jié)構(gòu)（尺寸大小約為20μm）。相比于純BC支架材料來說，致孔后的BC支架材料介孔比表面積能夠從56.87 m2/g上升至169.86 m2/g，孔隙率從28.3％提高至90.8%，最大吸水率也從997%增長到7611%。通過體外細胞生物相容性分析結(jié)果表明，多孔BC支架材料

9、因其孔隙率和孔體積的增加，在細胞培養(yǎng)的過程中能吸取更多的營養(yǎng)液和加速代謝物的傳輸，促進了植入細胞的生長、分化和繁殖。然而，盡管多孔BC支架材料在孔隙率方面滿足了臨床應(yīng)用的要求，但所具有的孔徑仍無法達到理想的尺寸大小，因此還需要對BC致孔工藝路線進行重新思考。
　?。?）采用微流體技術(shù)制備結(jié)構(gòu)規(guī)整和大小均一的瓊脂糖微球，并以此作為致孔劑在活性BC基質(zhì)生物反應(yīng)器上合成孔徑尺寸為300-500μm以及孔結(jié)構(gòu)相互貫穿的三維多孔BC關(guān)節(jié)軟骨

10、支架材料，解決了上述AC發(fā)泡致孔工藝難以擴大孔徑的缺點以及現(xiàn)有致孔劑濾出法中致孔劑大小均勻性差、支架材料宏觀形態(tài)不可控的限制問題。結(jié)果顯示，三維多孔BC支架材料不僅能夠?qū)崿F(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細胞的內(nèi)部滲入、轉(zhuǎn)移和復(fù)制的目標，還能展現(xiàn)出較高的細胞活性值。尤其是經(jīng)過14 d的培育后，關(guān)節(jié)軟骨細胞能夠均勻地分布在整個支架材料上并使其形成活性預(yù)移植體。因此基于結(jié)合微流體和生物發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)勢，開發(fā)了一種新型靈活的BC支架材料致孔技術(shù)，實現(xiàn)了BC孔結(jié)構(gòu)尺寸可

11、控筑造以及細胞三維分布生長的目標，拓展了多孔BC支架材料在關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。
　　總而言之，本論文通過生物合成法成功制備一系列BC/LRS復(fù)合支架材料，簡化了工藝流程步驟，調(diào)控了復(fù)合支架材料的微觀結(jié)構(gòu)且改善了支架材料的生物相容性。利用PVP和SA修飾BC表面，通過仿生礦化法制備了BC/HA復(fù)合支架材料，提高了HA晶體的成核速度且縮短了復(fù)合支架材料的礦化時間。通過模擬關(guān)節(jié)軟骨鈣化層的ECM，BC/HA復(fù)合支架材料對植入

12、的關(guān)節(jié)軟骨細胞產(chǎn)生良好的生物活性和分化促進作用。為改造BC致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，采用表面活性劑輔助AC發(fā)泡技術(shù)，在成型BC支架材料上構(gòu)造了穩(wěn)定均一的大孔結(jié)構(gòu)。相比之前報道的致孔方法，這種新型發(fā)泡技術(shù)更為簡單、有效和高產(chǎn)。將微流體制備的瓊脂糖微球作為致孔劑鋪散在活性BC基質(zhì)上，發(fā)酵培養(yǎng)2 d后，獲得具有孔結(jié)構(gòu)大小為300-500μm且連續(xù)貫通的三維BC大孔支架材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨細胞不僅能夠在最初植入過程中滲入到支架材料的內(nèi)部，還能在培育過