過表達ACE2對犬心房快速起搏所致的心房重構(gòu)的影響及機制研究.pdf

1、背景：
　　心房顫動(Atrial fibrillation，AF，簡稱房顫)，是臨床上最常見且難以治療、易復(fù)發(fā)的一種心律失常，已成為人類心血管疾病中的一大流行病。多種疾病例如缺血性、瓣膜性、炎癥性和老年退化性心臟疾病、高血壓等均易引發(fā)房顫，然而目前房顫的治療效果尚不盡如人意。
　　大量研究已證實腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin angiotensin system, RAS）在房顫的發(fā)生與維持中被不同程度地激活。血管緊張素

2、 II（Angiotensin II, Ang II）是RAS最重要的效應(yīng)分子，具有收縮血管、促進纖維化增生和心肌肥大等效應(yīng)，它能被血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（Angiotensin converting enzyme2, ACE2）轉(zhuǎn)化成為有保護性效應(yīng)的血管緊張素-（1-7）[Angiotensin-(1-7), Ang-(1-7)]。新近研究表明，過表達ACE2能拮抗Ang II介導(dǎo)的心房重構(gòu)效應(yīng)。心房重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的基本機制，改良心

3、房基質(zhì)成為防治房顫的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。有研究表明， Rac1在心肌細胞中可能經(jīng)上調(diào)結(jié)締組織生長因子（ Connective Tissue Growth Factor, CTGF）、N-Cadherin及Cx43這一途徑促進了心臟纖維化及心房重構(gòu)；Rad(Ras Associated with Diabetes) GTPase在心臟中能抑制CTGF的轉(zhuǎn)錄，經(jīng)Rho/Rhokinase途徑調(diào)節(jié)細胞骨架的重塑。然而，在房顫中Rac1和Rad GTPa

4、se的動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)機制尚不明確，過表達ACE2改善心房纖維化的機制需進一步探討。
　　目的：
　　本研究擬建立犬心房快速起搏模型，應(yīng)用心房外膜涂抹攜帶有ACE2基因的腺病毒的方法探討心房過表達 ACE2對改善犬心房快速起搏所致的心房重構(gòu)的影響及其分子機制。
　　方法：
　　入選28只成年健康的雜種犬(22±2Kg，雌雄不拘)，隨機分為4組，每組7只：Sham組（假手術(shù)組）、AF-Control組（心房快速起搏對

5、照組）、AF-EGFP組（心房快速起搏+涂染Ad-EGFP腺病毒）及AF-ACE2組（心房快速起搏+涂染Ad-ACE2腺病毒）。其中AF-ACE2組與AF-EGFP組犬心房外膜分別涂染帶有ACE2和EGFP的腺病毒，Sham組與AF-Control組犬不涂染腺病毒。除Sham組外，AF-Control組、AF-EGFP組和AF-ACE2組均予以持續(xù)心房快速起搏（450次/min）。2周后，4組犬行第一次開胸手術(shù)及心內(nèi)電生理檢查（Elec

6、trophysiological Study, EP），進行基因涂染。轉(zhuǎn)染3周后行第二次開胸手術(shù)及EP檢查，隨后處死，取心房組織標本進行一下研究：應(yīng)用蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin, HE）染色和天狼猩紅染色評價心房快速起搏所致的組織病理學(xué)改變；應(yīng)用免疫印跡技術(shù)評價RAS成員AT1R、AT2R、Apelin和Aplnr的表達，以探討過表達ACE2對RAS系統(tǒng)的影響；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡技術(shù)評價Rac1、Rad

7、 GTPase和Gem的表達，應(yīng)用免疫印跡技術(shù)和免疫組織化學(xué)熒光方法評價CTGF、α-SMA和N-Cadherin的表達，應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR方法評價c-jun、c-myc和c-fos的基因表達，以探討過表達ACE2對心房快速起搏所致的心房纖維化重構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：
　　兩次開胸手術(shù)中心內(nèi)電生理檢查結(jié)果相比，第二次手術(shù)中AF-Control組、AF-EGFP組及AF-ACE2組犬心房ERP均顯著降低， AERP頻

8、率適應(yīng)性也顯著下降，而Sham組犬心房ERP在基因轉(zhuǎn)染前后無明顯變化。同時，AF-EGFP組（4/7 vs.7/7）和AF-Control組（2/7 vs.7/7）犬房性心律失常的誘發(fā)率明顯上升，且持續(xù)時間顯著延長，而AF-ACE2組犬房性心律失常的誘發(fā)率(4/7 vs.3/7)及持續(xù)時間均無明顯變化，Sham組犬僅能誘發(fā)出短暫的房性心律失常。
　　組織學(xué)和分子生物學(xué)研究結(jié)果：HE染色可見實驗犬均無明顯出血及炎癥滲出等。假手術(shù)組細

9、胞間隙適中，纖維排列整齊；AF-Control組和AF-EGFP組心房肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)明顯的攣縮和斷裂；而上述異常在AF-ACE2組明顯減輕，與AF-Control組和AF-EGFP組相比，轉(zhuǎn)染 ACE2后心房肌纖維分布相對整齊，排列大致有序。天狼猩紅染色顯示AF-Control組和AF-EGFP組心肌間質(zhì)纖維化明顯，纖維組織增生顯著，膠原纖維分布廣泛，纖維化程度明顯強于Sham組和AF-ACE2組。定量分析結(jié)果表明 AF-ACE2

10、組的膠原面積明顯低于 AF-Control組和AF-EGFP組（P<0.0001），與Sham組無明顯差異（P=0.234）。
　　免疫印跡技術(shù)評價 RAS成員的表達，結(jié)果顯示 AF-Control組和AF-EGFP組AT1R蛋白的表達水平顯著高于Sham組和AF-ACE2組，而 AT2R蛋白的表達水平在 AF-Control組和 AF-EGFP組顯著降低。Apelin和Aplnr的蛋白表達在AF-Control組和AF-EGFP

11、組顯著降低，而過表達ACE2則顯著升高了兩者的表達水平（P<0.05）。
　　免疫印跡技術(shù)評價Rac1、Rad GTPase和Gem的表達結(jié)果顯示：AF-Control組和AF-EGFP組Rac1蛋白的表達水平顯著高于Sham組和AF-ACE2組（P<0.05）。而Rad GTPase的表達在AF-ACE2組顯著升高（P<0.0001），與Rad同屬于RKG家族的Gem在AF-Control組和AF-EGFP組的表達也顯著降低（P

12、<0.0001）。免疫組化方法評價 Rac1和 Gem所得結(jié)果與上述免疫印跡法的結(jié)果一致。免疫印跡技術(shù)評價CTGF、α-SMA和N-Cadherin的表達，結(jié)果顯示三者在AF-Control組和AF-EGFP組的表達均顯著升高，而過表達ACE2則逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。同時采用免疫組織化學(xué)熒光方法檢測α-SMA的表達，結(jié)果表明α-SMA主要分布在細胞胞漿之中，在AF-Control組和AF-EGFP組中可見大量的綠色熒光細胞且α-SMA的表達強

13、于Sham組和AF-ACE2組，與蛋白印跡的結(jié)果相一致。同時，Realtime RT-PCR結(jié)果顯示c-jun、c-myc和 c-fos的基因表達在 AF-Control組和 AF-EGFP組顯著升高，而在AF-ACE2組中過表達ACE2能降低三者的mRNA表達水平。
　　結(jié)論：
　　本研究結(jié)果表明：（1）過表達 ACE2可以降低房顫的誘發(fā)率和縮短房顫的持續(xù)時間；（2）過表達ACE2調(diào)節(jié)心房快速起搏所致的RAS失衡，顯著下調(diào)

14、AT1R的表達，上調(diào)AT2R、Apelin和Aplnr的表達；（3）過表達ACE2能調(diào)節(jié)Rac1和Rad GTPase的動態(tài)平衡，顯著下調(diào)Rac1的表達和上調(diào) Rad GTPase、Gem的表達，抑制纖維化相關(guān)因子CTGF、α-SMA和 N-Cadherin的表達以及下調(diào) c-fos、c-jun和 c-myc的基因表達，以改善心房纖維化重構(gòu)。
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明心房過表達ACE2能夠通過調(diào)節(jié)心房快速起搏所致的失衡RAS軸