沉默因子NRSF對環(huán)境重金屬鉛作用下SV2C的調(diào)控.pdf

1、研究目的：
　　鉛是一種自然界廣泛存在的有毒重金屬，鉛暴露可造成機體多個系統(tǒng)的損傷，尤其是對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。鉛的神經(jīng)毒性一直備受關注，但其毒性機制至今仍未完全闡明。大量的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元限制性沉默因子（Neuron-restrictive silencer factor, NRSF）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中具有十分重要的作用，它是一種含鋅指結(jié)構的轉(zhuǎn)錄因子，能特異性的與神經(jīng)元限制性沉默元件（Neuron-restrictive sile

2、ncer element, NRSE）結(jié)合，來抑制含NRSE基序的神經(jīng)特異性基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因?qū)π纬刹⒕S持神經(jīng)元的表型、神經(jīng)元突觸可塑性有十分重要的作用。突觸囊泡蛋白2C（Synaptic vesicle glycoprotein2C, SV2C）在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸的傳遞中起著重要的作用，我們前期研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露可導致小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞(Neuro-2a, N2a)中SV2C的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)，但鉛是如何改變SV2C基

3、因的轉(zhuǎn)錄水平仍不清楚。通過生物信息學技術發(fā)現(xiàn)SV2C啟動子區(qū)含有NRSE基序。故本研究建立鉛暴露大鼠模型，探討鉛暴露對大鼠海馬NRSF和SV2C表達的影響。以及建立體外培養(yǎng)的N2a細胞鉛暴露模型，探討鉛暴露對N2a細胞NRSF和SV2C表達的影響。最后，在鉛暴露的N2a細胞模型基礎上干擾NRSF的表達，觀察鉛暴露是否通過影響NRSF的表達來調(diào)控SV2C的轉(zhuǎn)錄水平。本研究為鉛暴露引起的神經(jīng)毒性機制提供線索，并為尋找新的治療鉛中毒藥物提供理

4、論依據(jù)。
　　實驗方法：
　　1、鉛暴露對斷乳SD大鼠海馬NRSF和SV2C表達的影響：性成熟雌性SD大鼠隨機分為空白對照組（雙蒸水）、低（0.5 g/L）、高（2.0 g/L）劑量醋酸鉛暴露組，采取自由飲水方式進行醋酸鉛暴露，連續(xù)暴露10 d后，按雌：雄為2:1合籠交配，將受孕成功的雌性大鼠繼續(xù)飲水方式暴露醋酸鉛，直至仔鼠斷乳（出生后3周）。雄性仔鼠在斷乳時，采用Morris水迷宮系統(tǒng)檢測大鼠的學習記憶能力；采用電感耦合等

5、離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）檢測大鼠全血和海馬組織中鉛含量；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（ Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測大鼠海馬NRSF和SV2C mRNA表達情況；進行蛋白免疫印跡法（Western blot, WB）檢測大鼠海馬NRSF和SV2C蛋白表達情況；采用免疫熒光法（Immunofluorescent, IF）檢測NRSF蛋白在大鼠海馬

6、組織各區(qū)域的表達情況。
　　2、鉛暴露對N2a細胞NRSF和SV2C表達的影響：在N2a細胞貼壁生長穩(wěn)定后，加入濃度梯度為0μM（空白對照組）、1μM和100μM的醋酸鉛進行染鉛處理培養(yǎng)48 h后，使用RT-PCR法檢測N2a細胞NRSF和SV2C mRNA的表達情況；采用IF法檢測NRSF蛋白的表達情況。
　　3、NRSF對SV2C mRNA的影響：100μM的醋酸鉛處理兩組N2a細胞，沉默組轉(zhuǎn)染NRSF-siRNA，對照

7、組轉(zhuǎn)染DDW，轉(zhuǎn)染后兩組同時鉛暴露處理48 h，使用RT-PCR和Western blot法分別檢測NRSF mRNA及蛋白水平的表達變化，采用RT-PCR法檢測SV2C mRNA的表達變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1、鉛暴露會引起大鼠的學習記憶能力下降：Morris水迷宮獲得性訓練實驗中發(fā)現(xiàn)，各組大鼠在訓練第4d的平臺逃避潛伏期總體上存在顯著差異。第4d各組大鼠潛伏期時間隨著鉛暴露劑量增加呈現(xiàn)濃度依賴性延長（P<0.05）。

8、Morris水迷宮空間探索實驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比較，低、高劑量鉛暴露組穿越平臺次數(shù)更少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且低、高劑量鉛暴露組間比較也有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　2、鉛暴露會引起大鼠的血鉛和海馬組織鉛水平增加：ICP-AES檢測表明，大鼠血鉛濃度和海馬鉛含量均隨著鉛暴露濃度增加而增加，且呈現(xiàn)一定的劑量反應關系（P<0.05）。
　　3、鉛暴露影響大鼠海馬NRSF的表達：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠海

9、馬NRSF mRNA表達水平隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應性增加（P<0.05）。WB檢測發(fā)現(xiàn)， NRSF蛋白表達水平也隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應性增加（P<0.05）。IF檢測發(fā)現(xiàn)，海馬CA1、CA3以及DG區(qū)NRSF蛋白表達水平隨著鉛暴露濃度的增加呈劑量反應性增加（P<0.05）。
　　4、鉛暴露影響大鼠海馬SV2C的表達：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬SV2C mRNA表達水平隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應性下降（P<0

10、.05）。WB檢測發(fā)現(xiàn)， SV2C蛋白表達水平也隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應性下降（P<0.05）。
　　5、鉛暴露影響N2a細胞中NRSF的表達：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，N2a細胞NRSF mRNA表達水平隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應性增加（P<0.05）。IF檢測發(fā)現(xiàn)，隨著鉛暴露濃度的增加，N2a細胞NRSF蛋白表達水平增強，且呈劑量反應關系（P<0.05）。
　　6、鉛暴露影響N2a細胞中SV2C mRNA的表達：R

11、T-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，N2a細胞SV2C mRNA表達水平隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應性下降（P<0.05）。
　　7、在100μM的醋酸鉛作用下，與對照組相比，NRSF沉默組N2a細胞NRSF mRNA及蛋白的表達水平均顯著下調(diào)（P<0.05），而SV2C mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　鉛暴露通過上調(diào)NRSF的表達來抑制其下游靶基因SV2C的轉(zhuǎn)錄水平，導致下調(diào)了SV2C mRNA的表達，