乙型肝炎代謝組學(xué)研究及加壓毛細(xì)管電色譜質(zhì)譜聯(lián)用平臺的搭建.pdf

1、目前，全世界總共有超過3.7億例感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的患者,乙型肝炎病毒的攜帶者在中國大約有1.2億例,而發(fā)展為肝硬化患者的比例約占全球肝硬化患者的1/3。乙型肝炎感染是肝硬化和肝癌的主要誘發(fā)因素之一，HBV基因具有高度變異性，臨床上采用核苷類藥物及干擾素進行治療，但對部分HBV患者療效欠佳。因此可靠無創(chuàng)的快速篩查技術(shù)，對于輔助乙肝患者病情判斷，監(jiān)測藥物療效和預(yù)后判斷是非常必要的。我們可通過代謝

2、組學(xué)的研究手段更好的了解乙型肝炎病變的過程以及與疾病相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)的代謝途徑，從而發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，進一步輔助臨床診斷。
　　在本研究中主要采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（gas chromatography time-of-flight mass spectrometer GC-TOFMS）和超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography quadr

3、upole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOFMS）兩類分析平臺對乙型肝炎患者和健康對照者的血清樣本進行了代謝組學(xué)研究，希望尋找到與疾病有密切聯(lián)系的潛在的生物標(biāo)志物。篩選過程主要通過多維模式識別分析（主成分分析 PCA和正交偏最小二乘法 OPLS-DA）和單維統(tǒng)計分析等算法，最終篩選出23個差異代謝物，進一步我們對所篩選的所有差異物分別做受試者工作特征曲線（ROC曲線），選取曲線下面積比

4、較大的物質(zhì)擬合成綜合變量，再做ROC曲線，最終選定膽堿、丙二酸、纈氨酸三者擬合綜合變量，曲線下面積（AUC）可達0.996，故這三個物質(zhì)作為生物標(biāo)志物在診斷時具有很高靈敏度和特異度。
　　加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）與質(zhì)譜聯(lián)用研究非常少。pCEC的流速一般為一分鐘幾百納升級，而質(zhì)譜納噴離子源的流速也為幾到幾百納升每分鐘的范圍，pCEC與納噴源的結(jié)合具有天然的優(yōu)勢。如果將pCEC的高柱效、高選擇性、高分辨率以及快速分離的特點同納噴源

5、質(zhì)譜的高靈敏度以及可以提供精確分子量和結(jié)構(gòu)的特點相結(jié)合，可以成為復(fù)雜體系樣品定性、定量強有力的分析工具。而且pCEC進樣量為納升級，這對于極其珍貴的生物樣本的檢測是高度契合的，如果將pCEC與納噴源質(zhì)譜聯(lián)用的平臺運用到代謝組學(xué)研究中，必將極大的推動代謝組學(xué)的發(fā)展。在本研究中初次搭建了pCEC-nano-tripleTOFMS的平臺，填補了這一領(lǐng)域的空白。
　　本論文的研究內(nèi)容主要包括以下幾個部分：
　　1.建立了基于N,O-

6、雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生的氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（GC-TOFMS）的分析技術(shù)方法，探討了正常人和乙型肝炎患者的血清代謝譜圖差異。利用多維統(tǒng)計的PCA和OPLS-DA來觀察乙型肝炎患者和健康者的代謝差異，接著使用了200次響應(yīng)排序檢驗來避免判別模型的過擬合。利用VIP值從建立的七重交互驗證的OPLS-DA模型中進行差異物的選擇，我們從檢測到的518個物質(zhì)中選取了247個VIP大于1的差異物。進一步對其做單維統(tǒng)計T檢

7、驗分析，以及倍數(shù)變化分析等多種運算，最終確定了10個重要的差異性代謝物,并利用KEGG等在線數(shù)據(jù)庫以及大量的文獻調(diào)研對其代謝通路進行闡釋。其中檸檬酸、烏頭酸、谷氨酰胺、二甲甘氨酸和丙二酸與乙型肝炎患者組的相關(guān)性較好，對其擬合的綜合變量做ROC曲線，AUC達到0.975，大于0.9，故這5個物質(zhì)作為生物標(biāo)志物在診斷時具有很高靈敏度和特異度。
　　2.分別采用UPLC-QTOFMS正離子模式和負(fù)離子模式對乙型肝炎患者和健康者進行了血清

8、代謝組學(xué)的研究。利用多維統(tǒng)計分析（PCA，OPLS-DA）和單維統(tǒng)計分析分別對兩套數(shù)據(jù)進行差異代謝物的篩選，最終從正離子模式檢測到的4762個物質(zhì)中找到了67個差異物，從負(fù)離子模式檢測到的3704個物質(zhì)中找到了61個差異物。進一步對其做倍數(shù)變化分析等多種運算找到13個重要的代謝差異物（其中8個來自正離子模式，5個來自負(fù)離子模式），涉及膽汁酸代謝、氨基酸代謝、膽堿代謝、花生四烯酸的代謝等。進而發(fā)現(xiàn)甘氨鵝去氧膽酸、纈氨酸、膽堿三個代謝物擬合

9、的綜合變量與HBV患者組的相關(guān)性較好，AUC可達0.953，可以看出這3個代謝物具有比較強的特異度和敏感度。
　　3.整合 UPLC-QTOFMS和GC-TOFMS檢測到的所有差異代謝物，將兩個平臺分別擬合的綜合變量重新擬合成新變量PRE3，然后對其做ROC曲線用來區(qū)分患者組與健康組，結(jié)果實現(xiàn)了AUC=1，具有很強的診斷率，進一步我們只利用了膽堿、丙二酸、纈氨酸三個物質(zhì)進行擬合做ROC曲線，AUC即可達到0.996，說明這3個物質(zhì)

10、具有很高的診斷準(zhǔn)確性，便于乙型肝炎的病情監(jiān)測及治療效果的監(jiān)測。
　　4.利用無死體積二通和電隔離槽成功地搭建了pCEC與Nano源TripleTOFMS連接的平臺，成功的解決了pCEC與質(zhì)譜連接時加電的技術(shù)難題，同時利血平檢測的靈敏度可達5 pg（信噪比大于300）,證明本平臺具有很好的檢測靈敏度。
　　本論文的內(nèi)容覆蓋了不同分析平臺的乙型肝炎代謝組學(xué)應(yīng)用研究，為將來全面理解乙型肝炎的病理機制提供了實驗基礎(chǔ)和一個新的視角。同