維生素D缺乏動物模型的建立及其應對結(jié)核抗原的免疫變化.pdf

1、背景及目的：
　　 中國是結(jié)核高疫情國家，是世界上22個結(jié)核病高負擔國家之一, 并且為耐藥結(jié)核病疫情最嚴重的國家之一。第四次全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查顯示全國結(jié)核發(fā)病率平均為367/10萬人，而重慶地區(qū)為549/10萬人，是結(jié)核病的高發(fā)地區(qū)，每年新發(fā)現(xiàn)4萬結(jié)核病患者，是京津滬的10余倍，其原因目前尚不清楚。重慶是著名的山城，地理氣候比較獨特，其年日照量全國最低，紫外線照射嚴重不足。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)63.16％的健康獻血者與6

2、6.67％的骨關節(jié)結(jié)核患者存在維生素D 缺乏。VD對免疫細胞的功能有著多方面的作用，體外研究表明VD 既可增強巨噬細胞的吞噬能力，又可抑制DC細胞成熟，并影響T細胞的分化及功能。
　　 （一）1，25(OH)2D3及其衍生物具有增強天然免疫作用，研究表明VD 缺乏與結(jié)核易感性密切相關，隨著25(OH)D水平的升高，感染危險降低，潛伏感染發(fā)展為結(jié)核病的危險也降低[3]。在結(jié)核化療前時代，光照療法和營養(yǎng)療法是治療結(jié)核病的主要措施，經(jīng)

3、皮膚合成和飲食攝入增加了體內(nèi)25 (OH) D和1，25(OH)2D3水平，結(jié)核治愈率提高至約25％，抗結(jié)核藥物發(fā)明后VD在結(jié)核病治療中逐漸被淡忘。近年來，VD免疫調(diào)節(jié)作用研究的興起、結(jié)核耐藥與抗結(jié)核藥物研發(fā)滯后的矛盾促使學者們重新重視VD在防治結(jié)核病中的應用[4]。重慶地區(qū)獨特的地理和氣候特點導致年日照量全國最低，紫外線照射不足而皮膚合成的VD 較少，因貧困經(jīng)飲食攝取VD不足，冬季VD缺乏較為普遍。VD與免疫系統(tǒng)的關系近年來受到廣泛關

4、注，通過黃光照射、去VD合成營養(yǎng)素飼料喂養(yǎng)建立的小鼠VD 缺乏模型，免疫機制嚴重紊亂，表現(xiàn)為T細胞亞群分布失調(diào)、免疫耐受減弱而自體免疫損傷加重，T淋巴細胞亞群分布紊亂、功能下降（Th2 抑制），提示1，25(OH)2D3在單核/巨噬細胞分化成熟中的重要意義，補充VD 8周后可恢復正常；因建立條件嚴格、耗時長，佝僂病研究中未被廣泛采用，但該模型為研究環(huán)境因素導致VD 缺乏對免疫系統(tǒng)影響的最理想模型。
　　 （二）1，25(OH)2

5、D3及其衍生物具有誘導免疫耐受減輕免疫自體損傷作用。1，25(OH)2D3能夠影響DCs 生命周期中所有的主要階段：阻礙單核細胞分化成DCs；阻止幼稚DCs 向成熟DCs分化, MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86表達下調(diào)，IL-12分泌減少，IL-10顯著增加，從而誘導出具有致耐受性表型和功能的未成熟DCs，未成熟DCs與T淋巴細胞的耐受性相關。然而VD 缺乏是否是結(jié)核的易感因素尚需要體內(nèi)實驗進一步證明。為研究VD

6、 缺乏在結(jié)核感染發(fā)病中的作用，我們首先建立了VD 缺乏小鼠模型，然后用卡介菌刺激，觀察體內(nèi)的免疫變化與正常小鼠刺激后的差別。
　　 方法：
　　 1．維生素缺乏純合成小鼠飼料的配制
　　 將雙蒸水50L平均分裝到容量為50L的金屬桶裝容器中，分別加入625g 瓊脂，在105 ℃加熱40分鐘，然后放入到60℃的保溫箱中備用。將比例稱量的各種原料放入混合機中混合30min，后加入到無塵粉碎機中粉碎，全部一次性通過20

7、0鉬篩。將其平均分成兩份分別加入到瓊脂溶液中，并加入脂溶性維生素溶液各250ml （一份含VD，一份未含），充分攪拌30min，室溫下冷卻1h，然后放入到-20℃冰箱中凍存。
　　 2．維生素缺乏動物模型的建立及評價
　　 36只懷孕2周的BALB/C小鼠，分為三組。正常組喂正常飼料、VD+組喂VD+飼料、VD-組 喂VD-飼料。VD-組 遮光黃光燈照射。剔除雄性子鼠，入組的子鼠正常組18只、VD+組15只、VD-組13

8、只，出生3周斷奶，飼養(yǎng)環(huán)境及飲食同母鼠。測4-10周、12周子鼠體重，8、12周時測每天子鼠飲食消耗量，同時觀察子鼠運動習性。12周時將上述三組子鼠剪尾取血100ul 離心取血清測VD水平，每組隨機取三只子鼠摘眼球取血，測白蛋白水平；將VD 缺乏子鼠10只隨機分為組I 繼續(xù)遮光+正常飲食，組II 正常環(huán)境+正常飲食，6周后摘眼球取血測VD水平。
　　 3．VD 缺乏子鼠體內(nèi)免疫機能變化的檢測
　　 尾靜脈取血測VD后將上

9、述三組子鼠每組取5只分別在其尾根部注射BCG（0.1mlBCG 含卡介苗0.05mg）0.1ml，再飼養(yǎng)六周，飼養(yǎng)環(huán)境同前。刺激6周后分離血清，-70℃ 凍存待檢；無菌分離脾淋巴細胞，調(diào)整濃度為5×106 cell/ml。取200μl 脾淋巴細胞懸液，流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T細胞百分比。間接ELISA 方法測定特異性IFN-γ和IL-10水平，及血清特異性抗體滴度。CCK-8 檢測脾淋巴細胞增殖情況，結(jié)果用刺激指數(shù)(Stimu

10、lation index，SI)表示，SI=A 實驗孔/A對照孔。如刺激指數(shù)<1,則用Annexin V-PI 試劑盒檢測是否凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 1．正常組與VD+組體重無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；VD+組、VD-組8周、12周日平均消耗飼料，經(jīng)統(tǒng)計學分析8周時有差異，12周時無差異。2．正常組、VD+組、VD-組血漿白蛋白分別為33.2±1.04、32.4±0.53、32.8±0.67（g/L），無統(tǒng)計學差異

11、。3．正常組與VD+組血漿VD水平無顯著差異，但VD-組血漿VD 含量下降到正常的20％以下，提示小鼠VD 缺乏模型建立成功；六周后，組I、組II VD水平分別為18.46±1.53、58.46±5.53 （nmol/L）（P＜0.001）。4．測子鼠血漿鈣水平分別為2.32±0.087、2.49±0.144、1.73±0.091（mmol/L），血漿磷水平分別為2.20±0.071、2.41±0.042、1.77±0.091（mmol

12、/L），經(jīng)統(tǒng)計學分析三組之間血漿鈣磷含量均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），正常組與VD+組無顯著差異（P＞0.05），VD-組與另外兩組均有顯著差異（P＜0.05）。5．BCG 刺激正常組、VD+組及VD-組6周后，脾淋巴細胞中CD4+細胞亞群百分率分別為28.64±0.59、24.86±0.49、30.1±0.8，CD8+為10.9±0.72、9.42±0.55、14.14±0.83，CD4+/CD8+的比值分別為2.64±0.19、2

13、.66±0.23、2.13±0.09，VD-組CD4+及CD8+淋巴細胞百分比均顯著上升尤其以CD8+上升幅度更大。6．血漿IFN-γ分別為 375.40±13.11、301.96±23.60、478.43±17.50（pg/ml），血漿IL-10分別為 27.35±2.81、28.55±0.72、21.47±1.34 （pg/ml），VD-組較其他兩組血漿IFN-γ 顯著上調(diào)而IL-10顯著下調(diào)。7．VD-組血清特異性抗TB-PPD抗

14、體顯著高于正常組及VD+組。8．三組脾淋巴細胞增值刺激指數(shù)分別為1.47±0.12、1.15±0.11、0.65±0.16，VD-抑制了脾臟T淋巴細胞在TB-PPD 刺激下的增殖能力，其中VD-組淋巴細胞出現(xiàn)顯著凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1．通過控制食物和光照，成功建立VD 缺乏BALB/c小鼠動物模型。
　　 2．在VD的天然來源中，紫外線的作用較飲食作用重要，但直接補充VD 效果顯著。
　　 3．V