海洋主要污損生物幼蟲早期附著的分子定量方法研究.pdf

1、海洋污損帶來的問題日益突出，而環(huán)保型防污技術(shù)的研發(fā)方興未艾。新型環(huán)保技術(shù)的著手點之一是基于表面微納米結(jié)構(gòu)的納米防污技術(shù)，這類納米涂層可以有效地抑制主要污損生物幼蟲（藤壺、牡蠣、貽貝、苔蘚蟲、海鞘、盤管蟲等）的附著。早期的海洋污損生物幼蟲是肉眼不可見的，因此本課題意在建立一種針對主要海洋污損生物早期幼蟲的快速識別定量技術(shù)，有助于快速鑒定微納米結(jié)構(gòu)涂層對污損生物幼蟲附著的抑制作用。
　　本課題首先在威海周邊收集到幾類主要海洋污損真核生

2、物，分析它們的18S rRNA基因序列，尋找其SNP（Single NucleotidePolymorphisms）位點，并借助SAP理論技術(shù)（Simple Allele-discriminating PCR）設(shè)計物種特異性的引物，基本要求是在10種主要污損生物之間進(jìn)行區(qū)分，共設(shè)計10對特異性引物；另外在個別污損生物科、種、屬之間進(jìn)行區(qū)分，主要針對藤壺及苔蘚蟲，共設(shè)計9對特異性引物。
　　隨后對上述設(shè)計的引物進(jìn)行了理論驗證，包括（

3、1）對污損生物純樣本模板的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；（2）對測序結(jié)果進(jìn)行Blast分析；（3）在Silva數(shù)據(jù)庫中檢測引物的覆蓋率，同時在匯總的分類信息中，通過查看具體的引物覆蓋范圍完成引物的理論評估。10種主要污損生物的各自引物都保留了科及以上分類層面的特異性。
　　最后對上述引物的特異性進(jìn)行了實驗驗證，包括（1）以純樣本為模板對引物特異性進(jìn)行篩選，共篩選出10對引物；（2）以威海小石島兩次掛板取樣得到的宏基因組作為模板對引物特異性進(jìn)行

4、驗證并借助Gel-Pro凝膠分析軟件完成相對定量分析；（3）最后選擇特異性最強(qiáng)的引物TH1（藤壺）和Bug1（苔蘚蟲）以第三次掛板取樣的混合樣本為模板進(jìn)行QPCR絕對定量，同時考察不同納米涂層表面幼蟲附著的情況。
　　本研究的結(jié)論和創(chuàng)新點是：（1）上述引物設(shè)計方法基本可以保證其擴(kuò)增特異性；（2）在國內(nèi)防污領(lǐng)域率先建立基于核糖體RNA基因單個堿基差異的主要污損生物早期幼蟲附著程度的定量測定方法；該方法將在后續(xù)研究中進(jìn)一步完善并擴(kuò)大到