Mig6對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥中表皮生長因子受體的負反饋作用.pdf

1、目的：本研究采用原代骨髓來源的巨噬細胞和THP1，分別抑制或過表達mig6基因與EGFR的磷酸化水平，研究對相互的影響，以及對下游炎癥因子TNF-α的作用。具體研究問題為:
　　1.mig6是否對EGFR的磷酸化具有負反饋調(diào)節(jié)的作用;
　　2.mig6與EGFR的相互作用是怎樣的，是否也對下游的TNF-α的產(chǎn)生有影響。
　　方法：1.實驗分組:
　　1)將培養(yǎng)后的THP1細胞或者BMM細胞根據(jù)LPS作用時間處理時

2、分為5個組:control組，15min組，30min組，1h組，2h組。
　　2)將培養(yǎng)后的THP1細胞或者BMM細胞給予抑制劑預(yù)處理時分為4個組:對照組，厄洛替尼(erlotinib)組（20μM），LPS組（500μg/L），LPS+ erlotinib組，使用抑制劑預(yù)處理30min后再使用LPS刺激1h。
　　3)根據(jù)轉(zhuǎn)染mig6-siRNA或過表達mig6病毒分組:NC組（陰性對照），NC+LPS組，siRNA/L

3、V-mig6組，siRNA/Lv-mig6+LPS組。siRNA或Lv-mig6轉(zhuǎn)染24-48h后LPS刺激。
　　2.siRNA/LV-mig6轉(zhuǎn)染沉默mig6基因:為了了解mig6的表達水平不同對EGFR磷酸化水平和分泌的TNF-α的影響，對THP1和巨噬細胞轉(zhuǎn)染siRNA和過表達mig6的病毒，24-48h完全換液終止轉(zhuǎn)染后，LPS刺激。siRNA轉(zhuǎn)染分組如下:NC組和siRNA組，檢測對mig6基因沉默的效果。
　　

4、3.酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測細胞上清TNF-α的表達:LPS刺激細胞4h，收集上清，使用檢測TNF-α表達水平。
　　4.PCR法檢測細胞中mig6的mRNA表達:細胞提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase Chain Reaction，Q-PCR)檢測mig6 mRNA的表達

5、情況。
　　5.western-blot檢測各組細胞磷酸化蛋白EGFR表達:給藥4h后，收集細胞并使用磷酸鹽緩沖液清洗2遍，使用western-blot法檢測細胞磷酸化蛋白EGFR和mig6的表達。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均數(shù)±標準差((x)±s)表示。不同時間點采用重復(fù)測量;兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗;多組比較采用單因素方差分析(one way ANVOA)，組間比較有顯

6、著差異時，方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett'sT3檢驗。α=0.05為檢驗水準。作圖使用GraphPad Prism5.0作圖軟件。
　　結(jié)果:1.LPS不同作用時間對mig6表達的影響:
　　在原代巨噬細胞中，LPS（預(yù)實驗測得濃度為500μg/L）作用1h時與其他作用時間的相比，mig6的mRNA表達升高明顯（P＜0.05），根據(jù)結(jié)果我們選取mig6 mRNA受到LPS刺激作用的時間為1h。
　　2.E

7、GFR的抑制劑對LPS誘導(dǎo)的mig6表達的影響:
　　原代巨噬細胞中，給予Elotinib（20μmol/L）預(yù)處理30min，分組給予LPS刺激1h，收集細胞進行PCR檢測mig6 mRNA表達，發(fā)現(xiàn)與LPS組相比，LPS+erlotinib組mig6基因表達明顯降低（(*)P＜0.05）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，LPS刺激4h，收集細胞進行蛋白提取，用western-blot法檢測mig6蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與LPS組相比，LPS+ erl

8、otinib組mig6蛋白表達明顯降低（(*)P＜0.05）差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.siRNA-mig6對LPS誘導(dǎo)的EGFR磷酸化水平和TNF-α的影響:
　　原代巨噬細胞和THP1中，轉(zhuǎn)染siRNA沉默mig6的基因表達，24-48h后進行終止，收集細胞進行蛋白提取，應(yīng)用westen-blot檢測mig6的蛋白表達是否被沉默，與陰性對照NC組相比，mig6的蛋白表達顯著降低（(*)P＜0.05）。LPS作用巨噬細胞3

9、0min收集細胞提取蛋白進行western-blot檢測，與NC+LPS組相比，siRNA+LPS組EGFR的磷酸化水平明顯升高（(*)P＜0.05）;LPS作用4h后收集細胞上清液用ELISA檢測TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)與NC+LPS組相比，siRNA+LPS組EGFR的磷酸化水平明顯升高（(*)P＜0.05）。
　　4.過表達mig6病毒對LPS誘導(dǎo)的TNF-α的影響:
　　原代巨噬細胞轉(zhuǎn)染mig6過表達的病毒，用PCR方法

10、檢測mig6的表達。與陰性對照NC-mig6組比較，Lv-mig6組mig6基因表達量增高。將各組細胞LPS作用4h后收集上清液用ELISA檢測分泌出胞外TNF-α的水平，與NC+LPS組相比，Lv-mig6+LPS組，TNF-α的表達量下降（*P＜0.05）。western-blot檢測EGFR磷酸化水平，與NC+LPS組相比，Lv-mig6+LPS組EGFR的磷酸化水平明顯降低（*P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.在巨噬細胞中，