纈沙坦與阿托伐他汀對(duì)心肌梗死后室性心律失常的影響及機(jī)制研究.pdf

1、在課題組既往研究基礎(chǔ)上，本研究擬通過建立MI動(dòng)物模型，進(jìn)一步證實(shí)縫隙連接重構(gòu)、交感神經(jīng)重構(gòu)與VAs的關(guān)系，探討MI后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系;并給予ARB纈沙坦、他汀類代表藥物阿托伐他汀干預(yù)，以期揭示二者抗心律失常作用及可能機(jī)制，為降低MI后VAs的發(fā)生提供新的思路，并為臨床上MI后ARB、他汀類藥物的早期應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。為明確闡述以上問題，本課題通過以下兩個(gè)部分進(jìn)行探討:
　　第一部分 纈沙坦對(duì)心肌梗死

2、后室性心律失常的影響及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　明確MI后縫隙連接重構(gòu)與VAs的關(guān)系，并行ARB纈沙坦干預(yù)研究，確定其具有抗心律失常作用，以期為MI后VAs的防治及ARB的臨床拓展應(yīng)用提供新的思路。
　　方法:
　　SD大鼠隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組（Sham組），心肌梗死組（MI組），ARB纈沙坦干預(yù)心肌梗死組（ARB組）。采用開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈制造MI大鼠模型，術(shù)后次日分別予以等容積生理鹽水及纈沙坦(30

3、mg/kg/day)灌胃。繼續(xù)喂養(yǎng)至8周，所有存活大鼠均行血流動(dòng)力學(xué)檢查，并接受活體程序電刺激試驗(yàn)以誘發(fā)VAs。每組各選取10只大鼠處死后立即取梗死灶周、非梗死左室游離壁(left ventricle free wall，LVFW)，利用免疫組織化學(xué)、Westernblot及透射電鏡等方法觀察Cx43的分布及數(shù)量;剩余各組大鼠行心室肌細(xì)胞分離，利用膜片鉗技術(shù)記錄心室肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流(transientoutward potassiu

4、m current,Ito)電流密度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以評(píng)價(jià)縫隙連接通道的功能。
　　結(jié)果:
　　1.MI組大鼠VAs誘發(fā)率較Sham組顯著增加(P＜0.01);射血分?jǐn)?shù)(ejectionfraction，EF)和心輸出量(cardiac output，CO)較Sham組顯著下降(P＜0.05)，左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)和左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/

5、dtmax)亦顯著降低(P＜0.05);免疫組織化學(xué)顯示與Sham組相應(yīng)部位相比，梗死灶周心肌組織Cx43分布不均一，含量降低（0.215±0.017，0.330±0.024，P＜0.05），心室肌細(xì)胞Ito電流密度下降。
　　2.與MI組相比，ARB組VAs誘發(fā)率顯著下降(P＜0.01);EF和CO顯著升高，±dp/dtmax亦顯著上升（P＜0.05），而左心室舒張末壓力(left ventricleend-diastolic

6、pressure，LVEDP)、LVSP下降(P＜0.05);梗死灶周心室Cx43含量增加（0.330±0.024，P＜0.05）、分布不均一的程度減輕，Ito電流密度部分恢復(fù)。
　　3.在LVFW，三組Cx43分布方式相對(duì)正常，但MI組Cx43含量與Sham組和ARB組相比顯著下降（P＜0.05），而在Sham組和ARB組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。
　　4.Western blot結(jié)果同上述;同時(shí)，電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，ARB纈沙坦干預(yù)

7、可在一定程度上恢復(fù)心肌梗死后異常的Cx43分布。
　　結(jié)論:
　　1.MI后縫隙連接表現(xiàn)出數(shù)量的減少，空間分布的異常及功能的改變等，即縫隙連接重構(gòu)，使心肌組織電傳導(dǎo)的一致性喪失，其是導(dǎo)致MI后VAs發(fā)生的機(jī)制之一;
　　2.MI后ARB纈沙坦干預(yù)能有效改善MI所致的縫隙連接重構(gòu)，部分恢復(fù)下降的Ito電流密度，從而降低MI后VAs的易感性和發(fā)生率。
　　第二部分 阿托伐他汀對(duì)心肌梗死后室性心律失常的影響及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)

8、研究
　　目的:
　　探討MI后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系，明確他汀類藥物阿托伐他汀干預(yù)對(duì)MI后巨噬細(xì)胞表型的影響及與MI后交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系，為MI后由交感神經(jīng)重構(gòu)引發(fā)的惡性心律失常的防治提供新的靶點(diǎn)，并為他汀類藥物在臨床的拓展應(yīng)用提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持。
　　方法:
　　Wistar大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組（Sham組），心肌梗死組（MI組），他汀類代表藥物阿托伐他汀干預(yù)心肌梗死組（Stati

9、n組）。開胸行左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制造大鼠MI模型，術(shù)后當(dāng)日分別給以等容積PBS溶液及阿托伐他汀(10mg/kg/day)灌胃。7天后，所有成活動(dòng)物行程序性電刺激誘發(fā)VAs。分離大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別給以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）+干擾素γ(interferionγ,IFN-γ）和白介素4(interleukin-4，IL-4)誘導(dǎo)細(xì)胞極化，選組1孔板LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激的巨噬細(xì)胞給以阿托伐他汀干預(yù)，并利用流

10、式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞極性，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞分泌的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)、M2型巨噬細(xì)胞分泌的精氨酸酶1(arginase1，Arg1)、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）相應(yīng)mRNA的表達(dá);利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色的方法觀察MI后梗死灶周巨噬

11、細(xì)胞浸潤情況及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth associated protein43，GAP43)和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性神經(jīng)纖維的密度與分布;Western blot檢測(cè)心肌組織中NGF蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)心肌中NGF相應(yīng)mRNA的表達(dá);ELISA檢測(cè)血清中NGF濃度。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)于分離的腹腔巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示LPS+IFN-γ和IL-4分別

12、成功誘導(dǎo)刺激巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化;LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激的細(xì)胞給以阿托伐他汀干預(yù)后，CD86/CD68雙染陽性表達(dá)率（CD86為M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，CD68巨噬細(xì)胞為標(biāo)記物）顯著下降，提示阿托伐他汀確實(shí)可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　2.對(duì)于分離的腹腔巨噬細(xì)胞，LPS+IFN-γ和IL-4誘導(dǎo)刺激組iNOS和Arg1水平與對(duì)照組比較顯著不同(P＜0.01)，提示巨噬細(xì)胞極性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功

13、。與對(duì)照組相比，LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激組IL-1β、TNF-α相應(yīng)mRNA表達(dá)和IL-4誘導(dǎo)刺激組IL-1β、TNF-α相應(yīng)mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01);但I(xiàn)L-4誘導(dǎo)刺激組二者表達(dá)水平低于LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激組。LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激的細(xì)胞給予阿托伐他汀干預(yù)后可明顯升高Arg1表達(dá);并逆轉(zhuǎn)IL-1β、TNF-α相應(yīng)mRNA的升高趨勢(shì)(P＜0.01)，提示阿托伐他汀干預(yù)后成功誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

14、
　　3.巨噬細(xì)胞浸潤:MI組梗死灶周存在大量CD68陽性巨噬細(xì)胞，且數(shù)量顯著高于Sham組(P＜0.01);CD163/CD68雙染來標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞(CD163為M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)，其在MI后第3天可計(jì)數(shù)到;與MI組相比，Statin組梗死灶周CD163陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加（P＜0.01），證實(shí)在MI后早期給以阿托伐他汀干預(yù)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型從M1型向M2型的轉(zhuǎn)化。
　　4.NGF蛋白及mRNA表達(dá):與Sham相比

15、，MI組NGF表達(dá)明顯上調(diào);給以阿托伐他汀干預(yù)后，NGF表達(dá)明顯下調(diào)。同時(shí)，NGF陽性的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯下降。
　　5.神經(jīng)支配:(1)GAP43陽性神經(jīng)纖維:Sham組幾乎不可見;與Sham組相比，MI組梗死灶周神經(jīng)纖維密度顯著增加;與MI組相比，Statin組神經(jīng)密度顯著降低;(2)TH陽性神經(jīng)纖維:Sham組可見其與心肌纖維一致的走形，分布均勻;與Sham組相比，MI組梗死灶周神經(jīng)密度顯著增加，且形態(tài)異常、空間分布混亂;與M