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文檔簡介
1、在課題組既往研究基礎(chǔ)上,本研究擬通過建立MI動物模型,進一步證實縫隙連接重構(gòu)、交感神經(jīng)重構(gòu)與VAs的關(guān)系,探討MI后巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化與心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系;并給予ARB纈沙坦、他汀類代表藥物阿托伐他汀干預(yù),以期揭示二者抗心律失常作用及可能機制,為降低MI后VAs的發(fā)生提供新的思路,并為臨床上MI后ARB、他汀類藥物的早期應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。為明確闡述以上問題,本課題通過以下兩個部分進行探討:
第一部分 纈沙坦對心肌梗死
2、后室性心律失常的影響及機制的實驗研究
目的:
明確MI后縫隙連接重構(gòu)與VAs的關(guān)系,并行ARB纈沙坦干預(yù)研究,確定其具有抗心律失常作用,以期為MI后VAs的防治及ARB的臨床拓展應(yīng)用提供新的思路。
方法:
SD大鼠隨機分成3組:假手術(shù)組(Sham組),心肌梗死組(MI組),ARB纈沙坦干預(yù)心肌梗死組(ARB組)。采用開胸結(jié)扎左冠狀動脈制造MI大鼠模型,術(shù)后次日分別予以等容積生理鹽水及纈沙坦(30
3、mg/kg/day)灌胃。繼續(xù)喂養(yǎng)至8周,所有存活大鼠均行血流動力學(xué)檢查,并接受活體程序電刺激試驗以誘發(fā)VAs。每組各選取10只大鼠處死后立即取梗死灶周、非梗死左室游離壁(left ventricle free wall,LVFW),利用免疫組織化學(xué)、Westernblot及透射電鏡等方法觀察Cx43的分布及數(shù)量;剩余各組大鼠行心室肌細胞分離,利用膜片鉗技術(shù)記錄心室肌細胞瞬時外向鉀電流(transientoutward potassiu
4、m current,Ito)電流密度并進行統(tǒng)計學(xué)分析,以評價縫隙連接通道的功能。
結(jié)果:
1.MI組大鼠VAs誘發(fā)率較Sham組顯著增加(P<0.01);射血分數(shù)(ejectionfraction,EF)和心輸出量(cardiac output,CO)較Sham組顯著下降(P<0.05),左室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)和左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/
5、dtmax)亦顯著降低(P<0.05);免疫組織化學(xué)顯示與Sham組相應(yīng)部位相比,梗死灶周心肌組織Cx43分布不均一,含量降低(0.215±0.017,0.330±0.024,P<0.05),心室肌細胞Ito電流密度下降。
2.與MI組相比,ARB組VAs誘發(fā)率顯著下降(P<0.01);EF和CO顯著升高,±dp/dtmax亦顯著上升(P<0.05),而左心室舒張末壓力(left ventricleend-diastolic
6、pressure,LVEDP)、LVSP下降(P<0.05);梗死灶周心室Cx43含量增加(0.330±0.024,P<0.05)、分布不均一的程度減輕,Ito電流密度部分恢復(fù)。
3.在LVFW,三組Cx43分布方式相對正常,但MI組Cx43含量與Sham組和ARB組相比顯著下降(P<0.05),而在Sham組和ARB組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。
4.Western blot結(jié)果同上述;同時,電鏡檢查發(fā)現(xiàn),ARB纈沙坦干預(yù)
7、可在一定程度上恢復(fù)心肌梗死后異常的Cx43分布。
結(jié)論:
1.MI后縫隙連接表現(xiàn)出數(shù)量的減少,空間分布的異常及功能的改變等,即縫隙連接重構(gòu),使心肌組織電傳導(dǎo)的一致性喪失,其是導(dǎo)致MI后VAs發(fā)生的機制之一;
2.MI后ARB纈沙坦干預(yù)能有效改善MI所致的縫隙連接重構(gòu),部分恢復(fù)下降的Ito電流密度,從而降低MI后VAs的易感性和發(fā)生率。
第二部分 阿托伐他汀對心肌梗死后室性心律失常的影響及機制的實驗
8、研究
目的:
探討MI后巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化與交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系,明確他汀類藥物阿托伐他汀干預(yù)對MI后巨噬細胞表型的影響及與MI后交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系,為MI后由交感神經(jīng)重構(gòu)引發(fā)的惡性心律失常的防治提供新的靶點,并為他汀類藥物在臨床的拓展應(yīng)用提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)實驗支持。
方法:
Wistar大鼠隨機分為3組:假手術(shù)組(Sham組),心肌梗死組(MI組),他汀類代表藥物阿托伐他汀干預(yù)心肌梗死組(Stati
9、n組)。開胸行左冠狀動脈結(jié)扎制造大鼠MI模型,術(shù)后當(dāng)日分別給以等容積PBS溶液及阿托伐他汀(10mg/kg/day)灌胃。7天后,所有成活動物行程序性電刺激誘發(fā)VAs。分離大鼠腹腔巨噬細胞分別給以脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)+干擾素γ(interferionγ,IFN-γ)和白介素4(interleukin-4,IL-4)誘導(dǎo)細胞極化,選組1孔板LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激的巨噬細胞給以阿托伐他汀干預(yù),并利用流
10、式細胞儀檢測巨噬細胞極性,實時定量RT-PCR檢測M1型巨噬細胞分泌的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(induciblenitric oxide synthase,iNOS)、M2型巨噬細胞分泌的精氨酸酶1(arginase1,Arg1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)相應(yīng)mRNA的表達;利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色的方法觀察MI后梗死灶周巨噬
11、細胞浸潤情況及生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein43,GAP43)和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽性神經(jīng)纖維的密度與分布;Western blot檢測心肌組織中NGF蛋白表達;實時定量RT-PCR檢測心肌中NGF相應(yīng)mRNA的表達;ELISA檢測血清中NGF濃度。
結(jié)果:
1.對于分離的腹腔巨噬細胞,流式細胞儀檢測提示LPS+IFN-γ和IL-4分別
12、成功誘導(dǎo)刺激巨噬細胞向M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化;LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激的細胞給以阿托伐他汀干預(yù)后,CD86/CD68雙染陽性表達率(CD86為M1型巨噬細胞標(biāo)記物,CD68巨噬細胞為標(biāo)記物)顯著下降,提示阿托伐他汀確實可促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化。
2.對于分離的腹腔巨噬細胞,LPS+IFN-γ和IL-4誘導(dǎo)刺激組iNOS和Arg1水平與對照組比較顯著不同(P<0.01),提示巨噬細胞極性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功
13、。與對照組相比,LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激組IL-1β、TNF-α相應(yīng)mRNA表達和IL-4誘導(dǎo)刺激組IL-1β、TNF-α相應(yīng)mRNA表達顯著升高(P<0.01);但IL-4誘導(dǎo)刺激組二者表達水平低于LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激組。LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激的細胞給予阿托伐他汀干預(yù)后可明顯升高Arg1表達;并逆轉(zhuǎn)IL-1β、TNF-α相應(yīng)mRNA的升高趨勢(P<0.01),提示阿托伐他汀干預(yù)后成功誘導(dǎo)M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化。
14、
3.巨噬細胞浸潤:MI組梗死灶周存在大量CD68陽性巨噬細胞,且數(shù)量顯著高于Sham組(P<0.01);CD163/CD68雙染來標(biāo)記M2型巨噬細胞(CD163為M2型巨噬細胞標(biāo)記物),其在MI后第3天可計數(shù)到;與MI組相比,Statin組梗死灶周CD163陽性細胞計數(shù)顯著增加(P<0.01),證實在MI后早期給以阿托伐他汀干預(yù)可促進巨噬細胞表型從M1型向M2型的轉(zhuǎn)化。
4.NGF蛋白及mRNA表達:與Sham相比
15、,MI組NGF表達明顯上調(diào);給以阿托伐他汀干預(yù)后,NGF表達明顯下調(diào)。同時,NGF陽性的巨噬細胞數(shù)量明顯下降。
5.神經(jīng)支配:(1)GAP43陽性神經(jīng)纖維:Sham組幾乎不可見;與Sham組相比,MI組梗死灶周神經(jīng)纖維密度顯著增加;與MI組相比,Statin組神經(jīng)密度顯著降低;(2)TH陽性神經(jīng)纖維:Sham組可見其與心肌纖維一致的走形,分布均勻;與Sham組相比,MI組梗死灶周神經(jīng)密度顯著增加,且形態(tài)異常、空間分布混亂;與M
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