活血消癭方對大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的作用及其機制研究.pdf

1、目的：探索實驗性大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫模型的建立;探討大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的發(fā)病機制及觀察活血消癭方對實驗性大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的作用;分別從活血消癭方對實驗性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠甲狀腺細胞凋亡、甲狀腺細胞增殖、甲狀腺血管生成、甲狀腺細胞趨化的影響等角度，探討活血消癭方對實驗性大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的作用機制。
　　 方法：
　　 1.實驗性大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫模型的制備和實驗分組處理:SD雄性大鼠60只，體重120-140g。大鼠編號

2、后隨機分為6組，即正常組、模型對照組、L-T4組、低劑量活血消癭方組、中劑量活血消癭方組、高劑量活血消癭方組，每組10只。正常組（按1ml/100g體重）灌服給予生理鹽水，其余各組均分別（按1ml/100g體重）灌服給予濃度為0.1％的丙基硫氧嘧啶(PTU)溶液，各組連續(xù)灌服8周。第9周起，L-T4組（按1ml/100g體重）灌服給予濃度為0.1mg/L的左甲狀腺素鈉(L-T4)溶液，低、中、高劑量活血消癭方組分別（按1ml/100g體

3、重）灌服給予濃度為44g/L、88g/L、176g/L的活血消癭方溶液，模型對照組（按1ml/100g體重）灌服給予蒸餾水，各組連續(xù)灌服8周，于造模結(jié)束后利用彩色多普勒判斷模型均制備成功。于第17周將大鼠麻醉后處死，頸動脈采血2ml，分離血清以備ELISA檢測;完整分離兩側(cè)甲狀腺，分別將各只大鼠左側(cè)甲狀腺分成兩部分:一部分用4％多聚甲醛固定，制作組織切片，用于免疫組化分析;一部分用2.5％戊二醛固定，制作超薄組織切片，用于電鏡觀察;分別

4、將各只大鼠右側(cè)甲狀腺切開分成兩部分，均-20℃凍存，一部分用于蛋白印跡分析，一部分用于流式細胞儀檢測。
　　 2.形態(tài)學觀察:超薄組織切片標本經(jīng)染色后采用電鏡觀察。
　　 3.蛋白印跡法:檢測大鼠甲狀腺組織中PCNA的表達。
　　 4.Annexin-V法結(jié)合流式細胞儀:檢測大鼠甲狀腺細胞的凋亡。
　　 5.ELISA法:檢測大鼠血清中VEGF的濃度。
　　 6.免疫組織化學法:檢測大鼠甲狀腺組織

5、中FGF-2、CXCR-4的表達，并用Image-Pro Plus6.0軟件對結(jié)果進行定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.電鏡下觀察超薄組織切片的結(jié)果表明:正常組大鼠的甲狀腺組織細胞質(zhì)內(nèi)有較多的溶酶體，各處可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面可見密布的核糖體小顆粒，細胞間的交界復合體清晰可見，濾泡腔內(nèi)充滿大小較為均勻一致的細小顆粒狀物質(zhì)，濾泡腔邊緣存在較多的微絨毛。模型對照組大鼠甲狀腺組織的濾泡上皮細胞高度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，內(nèi)

6、質(zhì)網(wǎng)的表面核糖體分布密集。與正常組相比，L-T4組及低、中、高劑量活血消癭方組溶酶體較少;與模型對照組相比，L-T4組及低、中、高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺組織的濾泡腔可見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴張較小，細胞質(zhì)內(nèi)多見游離的核糖體小顆粒。
　　 2.蛋白印跡法檢測PCNA表達的結(jié)果顯示:與正常組相比，模型組大鼠甲狀腺組織PCNA的表達顯著增多（P＜0.01）;與模型對照組相比，L-T4及低、中、高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細胞PCNA的表達均

7、顯著減少（P＜0.01）;與L-T4組相比，中、低劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細胞PCNA的表達均有顯著差異（P＜0.01），而高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細胞PCNA的表達無顯著差異;與低劑量活血消癭方組相比，中、高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細胞PCNA的表達均有顯著差異（P＜0.01）;與低劑量活血消癭方組相比，高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細胞PCNA的表達有顯著差異（P＜0.01）。隨活血消癭方的濃度增大而PCNA的表達降低更為明顯

8、，即高劑量活血消癭方對大鼠甲狀腺組織PCNA表達的抑制作用最為顯著。
　　 3.Annexin-V法結(jié)合流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果顯示:與正常組相比，模型對照組大鼠甲狀腺細胞的凋亡率顯著減少（P＜0.01）;與模型對照組相比，L-T4及低、中、高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細胞的凋亡率均顯著增大(P＜0.01);與低劑量活血消癭方組相比，中劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細胞的凋亡率增大（P＜0.05)，高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細

9、胞的凋亡率顯著增大（P＜0.01);與中劑量活血消癭方組相比，高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺細胞的凋亡率有顯著差異(P＜0.01)。
　　 4.ELISA法檢測血清中VEGF濃度的結(jié)果顯示:與正常組相比，模型對照組大鼠血清中VEGF的濃度顯著增大（P＜0.01）;與模型對照組相比，低劑量活血消癭方組大鼠血清中VEGF的濃度降低（P＜0.05)，L-T4及中、高劑量活血消癭方組大鼠血清中VEGF的濃度均顯著降低（P＜0.01）;與低

10、劑量活血消癭方組相比，高劑量活血消癭方組大鼠血清中VEGF的濃度有明顯差異（P＜0.05)，而中劑量活血消癭方組無顯著差異;與中劑量活血消癭方組相比，高劑量活血消癭方組大鼠血清中VEGF的濃度無明顯差異。
　　 5.免疫組織化學法檢測FGF-2表達的結(jié)果表明:與正常組相比，模型對照組大鼠的甲狀腺組織可見到FGF-2表達呈強陽性;與模型對照組相比，L-T4組及低、中、高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺組織FGF-2表達較少。定量的形態(tài)學

11、分析結(jié)果顯示，與正常組相比，模型對照組大鼠甲狀腺組織的FGF-2陽性表達面積和累積光密度顯著增大(P＜0.01);與模型對照組相比，L-T4組及低、中、高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺組織的FGF-2陽性表達面積和累積光密度均顯著降低（P＜0.01);與L-T4組相比，低劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺組織的FGF-2陽性表達的面積和累積光密度有顯著差異（P＜0.01)，中、高劑量活血消癭方組無顯著差異;與低劑量活血消癭方組相比，中、高劑量活血消

12、癭方組大鼠甲狀腺組織的FGF-2陽性表達面積和累積光密度均顯著降低(P＜0.01);與中劑量活血消癭方組相比，高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺組織的FGF-2陽性表達面積和累積光密度無顯著差異。
　　 6.免疫組化三步法檢測在各組大鼠甲狀腺組織中CXCR-4表達水平的結(jié)果表明:與正常組相比，模型對照組大鼠的甲狀腺組織可見到CXCR-4表達呈強陽性;與模型對照組相比，L-T4組及低、中、高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺組織CXCR-4表達

13、較少。定量的形態(tài)學分析結(jié)果顯示，與正常組相比，模型對照組大鼠甲狀腺組織的CXCR-4陽性表達面積和累積光密度顯著增大（P＜0.01）;與模型對照組相比，L-T4組及低、中、高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺組織的CXCR-4陽性表達面積和累積光密度均明顯降低（P＜0.01）;與L-T4組相比，低、中劑量活血消癭方組CXCR-4陽性表達的面積和累積光密度有顯著差異(P＜0.01)，高劑量活血消癭方組CXCR-4陽性表達的面積和累積光密度無顯著差

14、異;與低劑量活血消癭方組相比，中、高劑量活血消癭方組CXCR-4陽性表達的面積和累積光密度有顯著差異（P＜0.01）;與中劑量活血消癭方組相比，高劑量活血消癭方組大鼠甲狀腺組織的CXCR-4陽性表達面積和累積光密度無顯著變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.活血消癭方可改善結(jié)節(jié)性甲狀腺腫模型大鼠甲狀腺的微觀形態(tài)及結(jié)構(gòu)。
　　 2.活血消癭方可通過抑制結(jié)節(jié)性甲狀腺腫模型大鼠甲狀腺細胞的增殖、促進結(jié)節(jié)性甲狀腺腫模型大鼠甲狀