漢族人群冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病8和11號(hào)染色體易感基因位點(diǎn)掃描研究.pdf

1、目的：
　　 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(Coronaryarterydisease，CAD)是導(dǎo)致發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家死亡和致殘的重要原因之一，亦被人們公認(rèn)為是一種復(fù)雜的多因素紊亂疾病，包括環(huán)境和遺傳因素。許多環(huán)境危險(xiǎn)因素已經(jīng)被國(guó)內(nèi)外研究所明確，但冠心病分子遺傳學(xué)機(jī)制還尚不清楚。冠心病遺傳易感基因概念得到國(guó)內(nèi)外研究人員的重視，從基因水平去研究冠心病發(fā)病機(jī)制，從而為冠心病高危人群早期篩查和危險(xiǎn)因素預(yù)防提供依據(jù)成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)。冠

2、心病的全基因組掃描研究在世界各大研究中心相繼展開(kāi)，目前國(guó)內(nèi)對(duì)冠心病的遺傳學(xué)研究主要涉及冠心病的候選基因的研究，在漢族人群中關(guān)于冠心病的易感基因掃描研究甚少。本研究選取156例冠心病患者和1000例正常對(duì)照者分別建立病例組DNA混合池(DNApooling)和對(duì)照組DNA混合池，經(jīng)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記、聚合酶鏈反應(yīng)和電泳等基因掃描技術(shù)，確定漢族人群中8號(hào)和11號(hào)染色體上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的易感基因位點(diǎn)，為今后精確定位冠心病易感基因突變位點(diǎn)或多態(tài)性位

3、點(diǎn)打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收集冠心病患者156例作為病例組樣本。對(duì)照組是來(lái)自山東省血液中心的健康獻(xiàn)血者1000例。病例組和對(duì)照組均來(lái)自山東地區(qū)漢族人群，且符合個(gè)體與個(gè)體之間無(wú)血緣關(guān)系。
　　 2.取EDTA抗凝的患者與對(duì)照者外周靜脈血5mL，采用改進(jìn)的酚-氯仿法逐個(gè)提取基因組DNA。DNA濃度的測(cè)定是用BECKMANDU530紫外分光光度計(jì)，且每個(gè)樣本DNA濃度測(cè)量需2次以上，當(dāng)兩次

4、測(cè)量誤差小于10％時(shí)的兩個(gè)數(shù)值方可用于計(jì)算平均值，所得平均值作為其原液濃度。最后將每份DNA樣品均稀釋至濃度為20ng/μL。再取每個(gè)患者DNA樣品10μL充分混勻，構(gòu)建一個(gè)冠心病患者混合池，同理構(gòu)建一個(gè)正常對(duì)照者DNA混合池。
　　 3.以間隔10cM（厘摩）遺傳距離為標(biāo)準(zhǔn)選擇8號(hào)染色體上13個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，和11號(hào)染色體上18個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。
　　 4.在GeneAmpPCRSystem9700擴(kuò)增儀上，

5、分別以病例組DNA混合池和對(duì)照組DNA混合池中的DNA樣本做為模板進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增。然后在ABIAvant-3100毛細(xì)管遺傳分析儀上進(jìn)行電泳。
　　 5.經(jīng)上述分型后每個(gè)微衛(wèi)星遺傳位點(diǎn)都得到等位基因峰圖，運(yùn)用ABIGene.Mapper軟件對(duì)各位點(diǎn)等位基因峰圖進(jìn)行分析時(shí)，首先計(jì)算每個(gè)等位基因數(shù)目占所有等位基因數(shù)目的比率和每個(gè)位點(diǎn)的等位基因具體數(shù)目等，再運(yùn)用CLUMP軟件分析兩組間等位基因頻率差異，應(yīng)用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05

6、作為統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，確定有意義的遺傳易感位點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 8號(hào)和11號(hào)染色體基因掃描結(jié)果:經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終獲得了8號(hào)染色體上13個(gè)微衛(wèi)星遺傳位點(diǎn)和11號(hào)染色體上18個(gè)遺傳位點(diǎn)的全部分型結(jié)果，得到D8S264位點(diǎn)(8p23.3-p23.2)、D8S285位點(diǎn)(8q12.1)和D11S1338(11p15.4)3個(gè)位點(diǎn)的等位基因圖譜。通過(guò)CLUMP統(tǒng)計(jì)軟件分析比較病例組DNA混合池和對(duì)照組DNA混合池間的等位基因

7、頻率分布差異。發(fā)現(xiàn)8號(hào)染色體上的D8S264位點(diǎn)(8p23.3-p23.2)x2=17.114183,P=0.020000、D8S285位點(diǎn)(8q12.1)x2=13.018997,P=0.030000和D11S1338(11p15.4)位點(diǎn)x2=18.514360,P=0.010000差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)過(guò)多重PCR與電泳的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終證實(shí)了這三個(gè)遺傳位點(diǎn)的陽(yáng)性結(jié)果，提示這三個(gè)位點(diǎn)與冠心病呈現(xiàn)相關(guān)，在其附近可能存在冠

8、心病的易感基因位點(diǎn)突變或多態(tài)性改變。
　　 結(jié)論：
　　 在山東地區(qū)漢族人群冠心病患者中，D8S264位點(diǎn)(8p23.3-p23.2)、D8S285位點(diǎn)(8q12.1)和D11S1338位點(diǎn)(11p15.4)與冠心病呈現(xiàn)相關(guān)，在其附近可能存在冠心病的易感基因。還需在更大樣本中對(duì)于這一步得到的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行個(gè)體基因分型，精確定位漢族人群中在8號(hào)和11號(hào)染色體上冠心病易感基因位點(diǎn)突變或基因多態(tài)性的改變。
　　 意義：<

9、br>　　 目前全基因組關(guān)聯(lián)研究推崇兩階段研究設(shè)計(jì)策略，第一階段用DNA混合池的方法初步篩選出與冠心病相關(guān)的易感基因位點(diǎn)，第二階段就可以在更大的樣本中對(duì)于前一階段所得的陽(yáng)性結(jié)果重復(fù)驗(yàn)證，并對(duì)驗(yàn)證仍為陽(yáng)性位點(diǎn)進(jìn)行個(gè)體基因分型研究，這兩階段結(jié)合分析CAD易感基因位點(diǎn)是一種既經(jīng)濟(jì)又有較高把握度的研究策略。本研究通過(guò)基因掃描關(guān)聯(lián)分析的方法對(duì)8號(hào)染色體上13個(gè)遺傳位點(diǎn)和11號(hào)染色體上18個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行了初步篩選，發(fā)現(xiàn)了在8號(hào)和11號(hào)染