小麥赤霉病菌DON毒素及其降解基因Tri101的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是由鐮刀菌引起的谷類作物病害之一，其產(chǎn)生的單族毒素對人、畜毒性大，可引起多種中毒癥狀。禾谷鐮刀菌(Fusariumgramineartum Schwabe)Tri101基因編碼的單端孢酶烯3-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶通過加乙酰基的形式使單族毒素降解為低毒物質(zhì)。本文研究了禾谷鐮刀菌的DON毒素及其降解基因Tri101的克隆、表達和在小麥中的遺傳轉(zhuǎn)化，為作物脫毒和有效防治赤霉病奠定理論基礎(chǔ)，為

2、經(jīng)濟、安全和高效凈化食物和飼料中真菌毒素提供科學(xué)依據(jù)。主要包括：
　　 1.野生型禾谷鐮刀菌0623(F1. Grammearum 0623，簡稱Fg0623)在PDA平板上28℃分別培養(yǎng)3d、5d、7d，氣生菌絲生長旺盛，中心菌絲在培養(yǎng)第7d開始老化；菌落基質(zhì)由白色變?yōu)榧t色，部分基質(zhì)呈深紅色；在綠豆湯培養(yǎng)基中25℃、180rpm振動培養(yǎng)3d時，其鐮刀狀孢子清晰可見。在小麥培養(yǎng)基上25℃分別培養(yǎng)10d、20d、30d、40d、5

3、0d，高效液相色譜法測定DON的含量，結(jié)果顯示DON產(chǎn)量與培養(yǎng)時間呈近似拋物線型關(guān)系，在30d時最高，30d后迅速下降。
　　 2.利用RT-PCR克隆Fg0623的Tri101基因cDNA片段并測序，Tri101基因核苷酸序列閱讀框架全長1 356bp(GenBank序列號：GQ907236)，編碼451個氨基酸的多肽，推測分子量為49.45 kDa，等電點為5.14。氨基酸序列同源性比對結(jié)果表明，它與Kimura報道的禾谷鐮

4、刀菌Tri101氨基酸序列同源性最高，為99.56％，與其它13種鐮刀菌的Tri101氨基酸序列同源性分別為97.91％-75．68％。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，F(xiàn)g0623與F.sporotrichioides屬于同一進化枝且與F.asiaticum有較近的親緣關(guān)系，而與F.oxysporum、F.moniliforme、F.nygamai、F.nisikadoi和F.decemcellulare的親緣關(guān)系較遠。
　　 3構(gòu)建的

5、原核表達載體pGEX-4T2／Tri101轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG進行誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE分析表明，Tri101基因在BL21中高效表達，融合蛋白GST-Tri101分子量為75.45 kDa。將該融合蛋白切膠純化制備兔抗GST-Tri101多克隆抗體，經(jīng)ElISA法測定抗體效價為1:256 000，Western blot分析表明制各的抗體與原核細胞體外表達的Tri101蛋白可以特異性結(jié)合。應(yīng)用該抗體驗證了感赤霉病小麥中