勞爾氏菌降解木質素通用成分G單元相關基因的功能研究.pdf

1、木質素是含有氧代苯丙醇或其衍生物結構單元的芳香性天然有機高分子化合物，是世界上儲量僅次于纖維素含量的有機生物質。木質素可再生，雖能大量提供可再生芳基化合物，但難于生物降解，限制了木質素的應用前景和價值。木質素生物降解在自然界有機碳素的生物地球化學循環(huán)中起關鍵作用，是決定碳循環(huán)的限速步驟。愈創(chuàng)木基結構（又稱木質素G單元）是木質素中唯一一種在所有木素質中都普遍存在的通用構成單元，它的降解機制基本上代表了所有木質素的降解途徑，研究G單元的生物

2、降解對木質素的降解具有非常重要的現(xiàn)實意義，也對木質素來源的芳香族化合物（如造紙廠黑液）污染治理有著重要的作用。其中，木質素G單元系列化合物中代表化合物阿魏酸及其結構類似物羥基肉桂酸具有普遍研究關注度。因此，本研究以阿魏酸及其結構類似物為底物，研究勞爾氏菌對其的生物降解。勞爾氏菌是一種革蘭氏陰性細菌，可破壞植物細胞壁組織進入木質部導管而致病，因而可能降解木質素成分。根據勞爾氏菌基因組信息，我們發(fā)現(xiàn)其rsp0221-rsp0228基因可能和

3、阿魏酸的降解相關，rsp0221為二組分反應調節(jié)子，在勞爾氏菌對外界反應過程中起作用;rsp0222和rsp0223編碼O型香草酸脫甲基酶和O型脫甲基氧亞基氧化還原酶，負責將香草酸降解到原兒茶酸;rsp0225編碼肉桂酰輔酶A水解酶，負責肉桂酰輔酶A的脫氫反應，生成醛類物質;rsp0226編碼醛脫氫酶，將醛代謝到酸;rsp0227基因編碼肉桂酰輔酶A合成酶，負責對羥基肉桂酸的?；?另外，Rsc1285可能影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)對植物導管的侵入

4、。因此，本研究通過基因敲除和功能互補等技術構建上述相關基因突變體，研究其對木質素G單元（阿魏酸等）的生物降解及相關基因的功能作用。
　　本研究成功構建了勞爾氏菌sp0221基因和rsp0227基因缺失的突變菌株。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的阿魏酸對勞爾氏菌的生長有明顯抑制作用，而0.5g/L阿魏酸的添加對勞爾氏菌生長沒有影響，且在該濃度范圍下，勞爾氏菌可利用阿魏酸為唯一碳源生長。rsp0227基因缺失，使得其無法利用羥基肉桂酸為唯一碳源生長

5、，但可利用羥基肉桂酸代謝下游產物為唯一碳源生長，rsp0227基因互補菌株可以把rsp0227基因缺失突變體利用羥基肉桂酸為唯一碳源生長的能力恢復到野生型水平。表明Rsp0227負責勞爾氏菌對羥基肉桂酸的直接降解，即負責肉桂酰輔酶A的合成。rsp0221基因的缺失，并不影響勞爾氏菌利用羥基肉桂酸為唯一碳源的生長，表明Rsp0221可能和羥基肉桂酸的降解不直接相關。在對阿魏酸降解時，勞爾氏菌野生型和rsp0221基因缺失突變體在1天后可降

6、解高達90％的阿魏酸，而rsp0227基因缺失突變體喪失了對阿魏酸的降解能力。此外，勞爾氏菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)在其侵入植物導管的過程中起主要作用，能將一些效應蛋白注入到植物細胞內。因此，我們研究了阿魏酸對Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)，阿魏酸的添加明顯促進了勞爾氏菌野生型、rsp0221、rsp0227基因缺失突變體中Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因的表達水平（提高2-3倍），表明阿魏酸可能促進了勞爾氏菌對植物細胞破壞、侵入過程。當rsc1285基因缺失

7、時，勞爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的表達水平明顯降低了1/2，而rsc1285基因互補可以把其Ⅲ型分泌系統(tǒng)的表達水平恢復到野生型表達水平，表明Rsc1285是影響勞爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達的一個因子。勞爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)受到HrpB的直接控制，而hrpB的表達受到HrpG、PrhG的共同調控。本研究發(fā)現(xiàn)，Rsc1285通過HrpB控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因的表達，但和HrpB上游調控因子HrpG、PrhG無關。在侵染番茄植株時，rsc1285基因缺失突變