內生細菌在重金屬植物修復中的作用機理及應用研究.pdf

1、隨著工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，有毒重金屬污染越來越受到關注。重金屬能在生物體內累積，最終通過食物鏈危害人類的健康。傳統(tǒng)的重金屬污染土壤修復技術通常都耗費較高而且對環(huán)境有較大傷害。因此，急需一種行之有效且經(jīng)濟的去除環(huán)境中重金屬的方法。原位植物修復技術因其成本低、環(huán)境友好且行之有效而受到國內外研究者的關注，被認為是一種極具前景的污染環(huán)境修復方法。然而，重金屬的植物修復的實際應用還有不少問題亟待解決，譬如重金屬植物毒性、修復周期長且污染物提取量有限等。

2、現(xiàn)有的植物修復強化措施（譬如轉基因和螯合劑等）雖然有效但費用昂貴且對環(huán)境有潛在風險。因此，尋求一條經(jīng)濟且有效的微生物強化途徑提高植物修復效率將意義重大。
　　 本文自鎘超累積植物龍葵中分離得到多株內生菌，通過多種性能指標篩選菌株Serratia nematodiphila LRE07作為模式菌株，用以研究利用植物-內生菌共生系統(tǒng)強化植物修復的可行性。將菌株S.nematodiphila LRE07接種到龍葵種子后，通過營養(yǎng)液培養(yǎng)

3、方法深入研究了系列鎘處理濃度下龍葵植株生長、生理參數(shù)、光合成色素和鎘吸收累積特性，探討了內生菌接種對植物抗壓性能的影響。在此基礎上，研究了鎘脅迫下植物對營養(yǎng)元素的攝取、脂質過氧化水平和活性氧代謝的變化，以揭示內生菌在降低重金屬植物毒性和促進植物生長中的可能作用機制。另外，還研究了菌株S.nematodiphila LRE07的穩(wěn)定性和其在非宿主植物體內的作用效果。主要的研究內容和結果如下:
　　 ①龍葵內生菌的分離與篩選

4、　　 用于內生菌分離的龍葵植株采自株洲冶煉廠(27°52′N，113°05′ E)污水排水渠堤，自該植物不同組織體內分離得到97株內生菌，其中大部分為細菌。通過最小抑制濃度測定發(fā)現(xiàn)所有內生菌對重金屬均有不同程度抗性，這表明超累積植物是篩選重金屬抗性菌株的天然資源。自龍葵根部得到一株產(chǎn)深紅色色素的細菌，命名為LRE07。通過16S rDNA分析鑒定該菌株為沙雷氏菌株（Serratia nematodiphila）。S.nematodip

5、hila LRE07表現(xiàn)出對多種重金屬均有較高抗性，尤其是對銅、鎘和鉻。同時，對該菌株進行植物促生相關的生物學性能測定，結果發(fā)現(xiàn)S.nematodiphila LRE07具有產(chǎn)吲哚乙酸、鐵載體和增溶礦質磷酸鹽的能力。上述性能表明該菌株具有重金屬抗性和植物促生潛力，因此確定S.nematodiphila LRE07為下一步實驗菌株。
　　 ②內生菌接種對龍葵植株生長和鎘吸收的影響
　　 通過營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，研究龍葵植株對鎘

6、脅迫的響應和內生菌接種對植株抗壓性能的影響。接種21天和70天后取植物樣測定菌株接種效率。結果表明內生菌S.nematodiphila LRE07成功接種入植株體內，自宿主植物根部和地上部分組織內重分離得到的菌落數(shù)表現(xiàn)出依賴時間增長的趨勢，鎘脅迫未對內生菌生長造成抑制作用。上述結果表明S.nematodiphila LRE07能與宿主植物和諧共生。鎘濃度的遞增對龍葵生長造成了不同程度抑制作用，表現(xiàn)在植株的分蘗數(shù)、鮮重和株高。隨著重金屬接

7、觸時間延長，0μM和10μM濃度下接種植物和未接種植物的分蘗數(shù)比率均有增加，但高濃度（50和100μM）下分蘗數(shù)比率很快達到恒定值甚至在實驗后期減少。營養(yǎng)液中重金屬濃度越高，植物的分蘗數(shù)比率越低。在同一鎘脅迫濃度下，接種內生菌的植株分蘗數(shù)比率要高于未接種植株(P＜0.05，MANOVAs)，即接種植株的葉片數(shù)更多。內生菌接種對植株生長的有利影響在植株鮮重、株高和根重上也有體現(xiàn)。內生菌的積極意義在低鎘脅迫(10μM)下尤為顯著，在該濃度下

8、，接種植物生長未見顯著抑制，其生物量比未接種植株提高了58％。
　　 內生菌的接入對宿主植物植物光合作用色素含量有積極影響。隨著鎘濃度的升高和接觸時間延長，植物光和色素含量呈現(xiàn)線性減少趨勢。但是，在鎘脅迫條件下（除了100μM，第三天樣品外），接種內生菌的植物葉片中類胡蘿卜素、葉綠素a和葉綠素b的含量均要高于未接菌的植株(P＜0.05，MANOVAs)。另外，在同一鎘濃度下，由鎘脅迫導致的植物光合作用色素含量的減少量要明顯小于未

9、接菌植株，即接入內生菌的植株光合作用色素受鎘影響較小。
　　 隨著營養(yǎng)液中重金屬鎘濃度的增加，植物累積了大量鎘在其根部和地上部分。然而，內生菌接種與否對單位質量植物組織累積鎘沒有顯著差異（除了莖部，鎘10和100μM），即單位干重植株組織吸收的鎘量相近。相比于未接菌對照植株，雖然內生菌株的植入沒有極大改變重金屬鎘在其宿主植物組織中的濃度，但是提高了植物的生物量，由此產(chǎn)生的結果就是接菌的植物單株重金屬鎘提取量有極大提高（在10μM

10、 Cd條件下，增長量達到72±5％），這反映出內生菌的植入提高了植物提取效率。
　　 ③內生菌在降低重金屬植物毒性和促進植物生長中的可能作用機制
　　 Cd導致了植物組織中Fe含量的提高，然而Mn和Zn的含量均有所減少，除了根部Zn含量沒有顯著變化。這些結果表明Cd改變了其他重金屬離子在植物體內的傳輸。接種內生菌S.nematodiphila LRE07減緩了這種由鎘誘導了金屬含量變化。在10、50、100μM鎘濃度條件

11、下，接種內生菌株的植株各組織（根、莖、葉）中Mn的含量都要高于未接種植株。相比于未接菌對照，接菌植物在其葉部和頸部吸收了更多的Fe和Zn。
　　 不論接菌與否，植物組織中丙二醛含量隨著鎘濃度和接觸時間均呈現(xiàn)線性提高。但是，從結果可以看出，接菌植株的丙二醛含量要低于未接菌對照，雖然兩者之間沒有統(tǒng)計性差別。另外，丙二醛含量隨接觸時間的增加量在接菌植株中也要小得多。
　　 為了反映鎘脅迫條件下植物體內抗氧化代謝酶的活性，我們選

12、取了SOD，GPX，CAT和APX作為解毒活性氧毒害作用酶系的代表，測定了這些酶在鎘脅迫狀況下的變化。鎘誘導使得SOD含量顯著增加，在10μM和50μM鎘濃度條件下接菌植株SOD的活性要明顯要于未接種植物。CAT活性在兩種處理之間沒有顯著區(qū)別。10μM和50μM鎘條件下，接菌植物葉片中GPX和APX活性要明顯高于未接菌植物。鎘濃度的提高導致了兩種處理的植物的根部GPX含量都呈線性增加，但是在50μM和100μM鎘濃度條件下，接菌植株根部

13、GPX含量要明顯高于未接菌植株。上述結果表明接種內生菌株S.nematodiphila LRE07提高了宿主植物的抗氧化能力、降低了鎘脅迫導致的活性氧傷害。
　　 ④內生菌的穩(wěn)定性和在非宿主植物體內的作用
　　 通過比較不同處理的兩代植物體內內生菌菌落和植物生長狀況，探討內生菌在宿主植物體內的穩(wěn)定性。結果發(fā)現(xiàn)，兩代植物體內的目的菌株的菌落數(shù)沒有顯著性差異。PCR-DGGE圖譜分析顯示兩代植株體內細菌DNA呈現(xiàn)較高一致性。

14、同時傳代內生菌保存對植物生長的積極影響，兩代植株各項生長指數(shù)均沒有顯著性差異。這表明內生菌能能植物體內穩(wěn)定存活，并在植物子代中保持原有活性。
　　 將S.nematodiphila LRE07接種入豌豆并將植株置于鎘脅迫條件下以探討內生菌對非宿主植物的作用。結果發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫抑制植物種子萌發(fā)，內生菌接種沒能緩解重金屬對非宿主植物豌豆發(fā)芽率的脅迫影響。接種S.nematodiphila LRE07能提高植物生物量，對提高植物對抗重