南京幾種植原體病害的鑒定及銅錢樹叢枝病植原體致病機理的初步研究.pdf

1、植原體原稱類菌原體(MLO)，屬原核生物界柔膜菌綱，專性寄生于植物韌皮部的篩管細胞，主要通過取食植物韌皮部汁液的昆蟲傳播，難以進行人工體外培養(yǎng)。故傳統(tǒng)上依賴于微生物表型特征與生理生化特性等的分類方法難以應(yīng)用到植原體中，使得其檢測及分類多依賴于分子生物學(xué)手段。利用高度保守基因16SrDNA進行PCR檢測分析是目前國際上用于植原體分類研究的主要方法，基于該基因序列的PCR測序分析與PCR-RFLP分析已經(jīng)作為植原體初步分類體系被廣泛接受并應(yīng)

2、用。隨后，相對不及16S rDNA保守的基因，如rp、tuf、 secA、secY等基因也逐漸被應(yīng)用于親緣關(guān)系較近的植原體亞組和株系之間的分類研究中。本文主要基于以上基因并利用分子生物學(xué)手段對南京部分地區(qū)幾種疑似植原體病害的病原進行了分子檢測與鑒定，為進一步研究病害的發(fā)生規(guī)律、傳播特點及綜合防治等提供了理論基礎(chǔ)。
　　本研究首先利用DAPI染色方法初步觀察植原體在植物體內(nèi)的分布特點，在患病的二月藍植株嫩莖韌皮部附近觀察到特異性的熒

3、光亮點;又分別利用植原體的16S rDNA、rp基因、tuf基因及secY基因的通用引物對病株二月藍的總DNA進行巢式PCR擴增，均獲得與目的基因大小一致的特異性片段，測序后比對分析與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果均表明:患病二月藍中的植原體與16SrV-B亞組成員親緣關(guān)系較近，可以聚為一簇，屬于16SrV-B亞組成員，該結(jié)果與其16S rDNA的虛擬RFLP分析結(jié)果一致。其次，分別利用植原體的16S rDNA、rp基因的通用引物與設(shè)計的secA基

4、因的引物對病株銅錢樹的總DNA進行PCR擴增，均獲得與目的基因大小一致的特異性片段，測序后比對分析與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明:患病銅錢樹中的植原體也與16SrV-B亞組成員聚為一小進化分枝，屬于16SrV-B亞組成員，且與該植原體16S rDNA的虛擬RFLP分析結(jié)果一致。最后，利用植原體的16S rDNA的通用引物對患病的棕櫚、桃樹、矮牽牛、竹、玉簪這5種植物的總DNA分別進行巢式PCR擴增，均得到約1.2 kb大小的特異性目的條帶，測

5、序后比對分析、虛擬RFLP分析及基于它們的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果均表明，這5種植物中的植原體均與16SrV組成員之間親緣關(guān)系較近，可以聚為一大進化分枝，初步確定它們同屬于16SrV組成員，并暫時將它們劃分為不同的植原體株系。另外，本研究還基于目前全球已經(jīng)報道的16SrV組植原體數(shù)據(jù)，利用Maxent生態(tài)位模型和ArcGIS軟件對16SrV組植原體在南京的潛在分布情況進行預(yù)測，同時結(jié)合實際調(diào)查及檢測結(jié)果進行分析，表明南京

6、的中部與北部地區(qū)屬于該類病害發(fā)生的中風(fēng)險區(qū)，而南京南部地區(qū)鄰近高風(fēng)險區(qū)，更適于該類病害的分布。
　　植原體的致病機理研究對植原體的防治具有極其重要的意義。在病害的發(fā)生和發(fā)展過程中，植物體內(nèi)酶的活性及某些代謝物的含量變化在一定程度上反應(yīng)了寄主與病原物的互作關(guān)系，它們參與植物的抗逆性反應(yīng)，有助于從生理生化方面理解植原體的致病機理。植物中的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗壞血

7、酸過氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)等與植物的抗氧化作用及防御反應(yīng)密切相關(guān)。通過測定不同生長期健康與患病銅錢樹葉片中上述6種酶活性以及丙二醛(MDA)、可溶性總糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染植原體的銅錢樹中上述6種酶活性以及丙二醛與可溶性糖含量較健康植株均呈現(xiàn)不同程度的升高趨勢，可溶性蛋白質(zhì)含量則較健康植株減少;除PPO活性變化不明顯外，其它酶的活性及代謝物的含量隨著植物生長時期的不同也表現(xiàn)出不同程度的變化，往往隨

8、著植原體的生長及繁殖活動程度增加即植物患病程度加劇其變化程度表現(xiàn)較為顯著。
　　胸苷酸激酶(TMK)可以催化磷?；鶊F從ATP轉(zhuǎn)移到dTMP形成dTDP，是植原體DNA合成時形成dTTP補救途徑中的關(guān)鍵酶，對植原體的生存必不可缺。本研究對16SrV-B亞組中的銅錢樹叢枝病植原體的胸苷酸激酶基因進行了克隆、原核表達及酶活性測定分析。經(jīng)克隆測序后比對結(jié)果顯示:該植原體的胸苷酸激酶核苷酸序列與JWB植原體的完全一致。將該胸苷酸激酶與已報道

9、的植原體胸苷酸激酶的氨基酸序列比對分析顯示:PahWB植原體TMK的氨基酸序列與OY植原體TMK-a、WBD植原體TMK-1、PaWB植原體TMK-a-1及PaWB植原體TMK-a-2的氨基酸序列相似性較高，而與OY植原體TMK-b、WBD植原體TMK-2、PaWB植原體TMK-b的氨基酸序列相似性較低。該胸苷酸激酶在大腸桿菌中成功完成表達，純化后獲得純度較高的大小約28 kDa的融合目的蛋白，但經(jīng)雙酶分析法測定結(jié)果表明該酶幾乎沒有活性