重組厭氧芽胞梭菌eglA p-Her2-neu-IL12融合基因穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：構(gòu)建重組厭氧芽胞梭菌saccharobutylicumβ-1，4葡聚糖內(nèi)切酶啟動子及信號肽(eglAp)-人表皮生長因子受體2胞外區(qū)(hHer2/neu ECD)-人白細(xì)胞介素12(rhIL12)融合基因穿梭表達(dá)載體(pIMP1eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL12)，為進(jìn)一步制備eglAp-hHer2/neu-rhIL12融合基因修飾的重組厭氧芽胞梭菌，進(jìn)行Her2/neu陽性實(shí)體腫瘤基因治療的研究奠定基礎(chǔ)。

2、>　　 方法：①以含有全長hHer2/neu序列的真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1 hHer2/neu)為模板，采用PCR方法，擴(kuò)增hHer2/neu ECD基因片段(1896bp)，通過酶切連接的方法，將其插入重組rhIL12真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6 rhIL12(p1)dP的rhIL12基因上游，獲得pcDNA6 hHer2/neu ECD-rhIL12(p2)真核表達(dá)質(zhì)粒。②設(shè)計合成eglAp基因中一段55bp序列作為模板，通過連

3、續(xù)PCR的方法，擴(kuò)增eglAp基因片段(335bp)，并構(gòu)建T-eglAp(p3)亞克隆質(zhì)粒。③通過酶切連接的方法，將eglAp片段插入p2質(zhì)粒中的hHer2/neu ECD基因上游，構(gòu)建pcDNA6 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL12(p4)真核表達(dá)質(zhì)粒。④以p4真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增eglAp-hHer2/neuECD-rhIL12融合基因片段(4.0kb)，通過in-fusion技術(shù)，將其插入pIMP1穿梭表達(dá)

4、質(zhì)粒，構(gòu)建重組pIMP1 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL12(p5)穿梭表達(dá)載體，并進(jìn)行菌液PCR、酶切及測序鑒定。
　　 結(jié)果：①獲得hHer2/neu ECD基因片段和pcDNA6 hHer2/neu ECD-rhIL12真核表達(dá)質(zhì)粒。②獲得eglAp基因片段和T-eglA p亞克隆質(zhì)粒。③獲得pcDNA6 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL12真核表達(dá)質(zhì)粒。④獲得eglAp-hHer2/ne

5、u ECD-rhIL12融合基因片段及重組pIMP1 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL12穿梭表達(dá)載體，其PCR產(chǎn)物和酶切片段與預(yù)期一致，測序結(jié)果證實(shí)融合基因各序列與GenBank中序列一致。
　　 結(jié)論：成功地構(gòu)建了重組大腸桿菌-厭氧芽胞梭菌融合基因穿梭表達(dá)載體(pIMP1eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL12)，為進(jìn)一步制備eglAp-hHer2/neu-rhIL12融合基因修飾的厭氧芽胞梭菌，