新型雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器的研制與應(yīng)用.pdf

1、第一部分新型雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器研制
　　 研究背景：
　　 肝功能衰竭是各種肝病的終末期表現(xiàn)?；颊卟∏槲Ｖ?病死率高。肝臟移植手術(shù)是目前公認有效的治療方法。但由于供體缺乏、高額的治療費用以及患者需長時間服用免疫抑制劑等原因,極大地限制了肝移植手術(shù)的廣泛開展。以體外培養(yǎng)肝細胞為基礎(chǔ)的生物人工肝等治療手段的出現(xiàn),有望使部分患者肝功能自行恢復(fù)或順利完成肝移植手術(shù)。然而,如何合理設(shè)計新型生物反應(yīng)器,實現(xiàn)體外肝細胞的大規(guī)

2、模培養(yǎng)及其培養(yǎng)過程中肝細胞功能與活率的有效維持,仍是目前強烈限制生物人工肝發(fā)展的瓶頸問題,也是目前亟待解決的重要課題。
　　 生物反應(yīng)器是整個BAL的核心部分,其性能將直接關(guān)系到生物人工肝的支持效果。理想的生物人工肝生物反應(yīng)器應(yīng)滿足如下條件:1.為肝細胞提供良好生長和代謝環(huán)境；2.實現(xiàn)有效的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及代謝產(chǎn)物雙向物質(zhì)傳輸；3.保護肝細胞免受體內(nèi)的免疫損傷；4.可進一步擴大培養(yǎng)規(guī)模,滿足臨床治療需求；5.最大可能減小反應(yīng)器內(nèi)

3、的培養(yǎng)死腔。為此,國內(nèi)外學者研制出了各種結(jié)構(gòu)形態(tài)的生物反應(yīng)器,主要有四種模式:中空纖維型、單層平板培養(yǎng)型、灌流平板/支架型、包裹式微球/懸液或柱狀反應(yīng)器及其它結(jié)構(gòu)復(fù)雜的復(fù)合式生物反應(yīng)器等。雖然經(jīng)過二十余年發(fā)展,已有部分生物人工肝生物反應(yīng)器已進入臨床實驗,但目前仍未有一種理想的生物反應(yīng)器可充分滿足臨床運用需要。
　　 大量研究表明,由美國航空航天局(NASA)設(shè)計的50ml小體積旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(The Rotary Cell

4、Culture System,以下簡稱RCCS-1),由于其獨特的低剪切力、高效物質(zhì)交換,持續(xù)模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境可增強體外培養(yǎng)細胞與細胞間接觸,形成三維結(jié)構(gòu)樣組織,促進細胞增殖分化,改善及維持體外培養(yǎng)細胞功能,目前已成功廣泛地運用于胚胎干細胞、角膜細胞、骨骼肌細胞、成骨細胞等多個組織工程領(lǐng)域中。
　　 為進一步深入研究微重力生物反應(yīng)器作為一種新型生物人工肝生物反應(yīng)器的可行性本課題組引進了美國航空航天局(National Aero

5、nautics and SpaceAdministration簡稱NASA)設(shè)計的500ml體積的新型旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器(Rotary Culture MWTM,簡稱RCMW),但經(jīng)過反復(fù)的實驗研究表明,美國航空航天局生產(chǎn)的RCMW微重力生物反應(yīng)器在設(shè)計上存在嚴重的缺陷,完全不能滿足生物人工肝生物反應(yīng)器的需求,為此,本課題擬通過對RCMW微重力生物反應(yīng)器設(shè)計上存在的問題進行優(yōu)化改進,設(shè)計出一種具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型雙向旋轉(zhuǎn)灌注式微

6、重力生物反應(yīng)器,為新一代生物人工肝生物反應(yīng)器的發(fā)展開辟一個新的方向與思路。
　　 研究目的：
　　 通過對RCMW微重力生物反應(yīng)器設(shè)計上存在的問題進行優(yōu)化改進,設(shè)計出了一種新型雙向旋轉(zhuǎn)灌注式微重力生物反應(yīng)器。
　　 研究方法：
　　 在美國NASA公司RCMW微重力生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)上,通過內(nèi)芯及循環(huán)模式優(yōu)化構(gòu)建,形成由流向控制器、細胞培養(yǎng)罐、培養(yǎng)液池、蠕動泵動力系統(tǒng)、膜肺、供氣系統(tǒng)組成的新型雙向旋轉(zhuǎn)灌注微

7、重力生物反應(yīng)器系統(tǒng)。人肝細胞(CL-1)在RCMW微重力生物反應(yīng)器(RCMW組)、外置氧合器RCMW微重力生物反應(yīng)器(RCMW高氧組)及雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器(雙向反應(yīng)器組)中,持續(xù)微載體三維培養(yǎng)7天,并通過MTT染色、細胞計數(shù)、培養(yǎng)上清中ALT、AST、白蛋白、尿素濃度等指標測定,比較各組肝細胞活力、數(shù)量和功能差異。
　　 計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差

8、分析,每組不同時間點之間的分析采用單組的重復(fù)測量方差分析,同一時間點的不同組別之間采用單向方差分析,當方差不齊時采用Welch方法。多重比較當方差齊性時采用LSD方法,當方差不齊時采用Tamhane'sT2方法。檢驗水準a=0.05.
　　 研究結(jié)果：
　　 美國NASA公司商品化RCMW微重力生物反應(yīng)器存在微載體/細胞堵塞,雙向物質(zhì)交換效率低下及出現(xiàn)培養(yǎng)死腔等缺點;而改進后雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器中雙向物質(zhì)交換效率

9、明顯提高,微載體/細胞均勻分布于整個培養(yǎng)罐中,不存在培養(yǎng)死腔。倒置顯微鏡下形態(tài)學及MTT細胞活力染色結(jié)果可見,雙向反應(yīng)器組人肝細胞(CL-1)的數(shù)量與活力均明顯優(yōu)于RCMW組及RCMW高氧組。生長曲線結(jié)果顯示,RCMW組、RCMW高氧組及雙向反應(yīng)器組人肝細胞密度均為先升高后逐漸下降,分別于第2天、第3天、第5天達肝細胞密度峰值8.8±0.57×105個/ml、12.92±0.98×105個/ml、32.58±1.44×105個/ml,且

10、雙向反應(yīng)器組人肝細胞密度于第2至7天均明顯高于RCMW組及RCMW高氧組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。肝細胞功能結(jié)果顯示,RCMW組、RCMW高氧組及雙向反應(yīng)器組白蛋白、尿素合成功能均為先升高后逐漸下降,分別于第3天、第3天及第5天達峰值,且雙向反應(yīng)器組上清白蛋白、尿素濃度于第1至7天均明顯高于RCMW組及RCMW高氧組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。此外,雙向反應(yīng)器組上清ALT、AST濃度于第1至7天均明顯低于RCMW組

11、及RCMW高氧組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 研究結(jié)論：
　　 本研究通過對RCMW微重力生物反應(yīng)器設(shè)計上存在的問題進行優(yōu)化改進,成功設(shè)計出了一種新型雙向旋轉(zhuǎn)灌注式微重力生物反應(yīng)器,可有效解決商品化RCMW微重力生物反應(yīng)器中存在的各種設(shè)計缺點,大大提高體外培養(yǎng)人肝細胞的密度、活率及功能,有望成為新一代生物人工肝生物反應(yīng)器。
　　 第二部分雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器人肝細胞、肝星形細胞共培養(yǎng)研究<

12、br>　　 研究背景：
　　 如何能盡最大可能地模擬肝細胞體內(nèi)生存的微環(huán)境,使肝細胞能持續(xù)大量增殖分化,保持較高生物活性,且較好地保持肝細胞的各種生物功能是目前限制生物人工肝體外肝細胞規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)展的瓶頸問題。為此,人們不斷改進肝細胞體外培養(yǎng)方法。
　　 體內(nèi)肝臟細胞由肝實質(zhì)細胞和肝竇內(nèi)皮細胞、肝星形細胞及庫否細胞等肝非實質(zhì)細胞組成。它們在錯綜復(fù)雜的三維細胞外基質(zhì)中,通過細胞-細胞與細胞-細胞外基質(zhì)間的相互通訊,精確地

13、發(fā)揮著各自特異的生物學功能。這些重要的體內(nèi)生理調(diào)節(jié)作用對于體內(nèi)肝細胞功能與活性具有重要的作用。目前很多肝細胞體外培養(yǎng)研究中都在嘗試盡可能地模擬體內(nèi)這種生理結(jié)構(gòu),并經(jīng)過長期的研究已經(jīng)表明,通過與庫否細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞及成纖維細胞等肝內(nèi)外非實質(zhì)細胞共培養(yǎng),可顯著增強并維持體外培養(yǎng)肝細胞的各種肝特異性功能。肝星形細胞位于肝葉Disse間隙內(nèi),可合成大量ECM、攝取并貯存維生素A。正常肝組織內(nèi)星形細胞的數(shù)量雖然不多(約占肝小葉的1％),但其

14、細胞表面細長突起和皺折大大增加了其與肝實質(zhì)細胞微絨毛的接觸面,從而形成以星形細胞為中介的三位一體的結(jié)構(gòu)功能單位,稱為星形細胞單位。將肝實質(zhì)細胞和星形細胞混合培養(yǎng)可望獲得與肝小葉相似的功能,為生物人工肝提供具有良好生理功能的肝細胞來源。
　　 本課題在前期工作中研制成功具有自主知識產(chǎn)權(quán)雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器,與目前現(xiàn)存的其它類型生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)相比,有如下優(yōu)點:低剪切力,對細胞損傷小:高效的雙向物質(zhì)交換:持續(xù)模擬微重力環(huán)境

15、有利于細胞增值分化,有利于細胞與細胞間接觸,形成三維結(jié)構(gòu)樣組織易于細胞規(guī)模化培養(yǎng)等優(yōu)點,現(xiàn)為最大可能地模擬肝細胞體內(nèi)生存的微環(huán)境,使肝細胞能持續(xù)大量增殖分化,保持較高生物活性,較好地保持肝細胞功能,本課題擬在前期雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器微載體人肝細胞的基礎(chǔ)上,進一步進行微載體人肝細胞、人肝星形細胞三維共培養(yǎng)研究。
　　 研究目的：
　　 通過人肝細胞、肝星形細胞微載體三維共培養(yǎng)進一步提高肝細胞數(shù)量、活力及功能。

16、>　　 研究方法：
　　 人肝細胞在微載體三維靜置培養(yǎng)(微載體靜置單培養(yǎng)組)、微載體人肝細胞、肝星狀細胞三維靜置共培養(yǎng)(微載體靜置共培養(yǎng)組)、雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器微載體三維培養(yǎng)(雙向反應(yīng)器單培養(yǎng)組)及雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器微載體人肝細胞、肝星狀細胞三維共培養(yǎng)(雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組)四種不同培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)7天。通過掃描電子顯微鏡、倒置顯微鏡觀察及MTT染色比較各組肝細胞生長的形態(tài)、細胞活力差異,并通過細胞計數(shù)、培

17、養(yǎng)上清中ALT、AST、白蛋白、尿素濃度等指標測定,比較各組肝細胞數(shù)量和功能差異。
　　 計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析,每組不同時間點之間的分析采用單組的重復(fù)測量方差分析,同一時間點的不同組別之間采用單向方差分析,當方差不齊時采用Welch方法。多重比較當方差齊性時采用LSD方法,當方差不齊時采用Tamhane'sT2方法。檢驗水準a=0.05.
　

18、　 研究結(jié)果：
　　 倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡及MTT細胞活力染色結(jié)果可見,微載體靜置共培養(yǎng)組及雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組中,多個微載體間借“細胞橋”相互聚集在一起組成較大的微載體細胞組織塊,細胞數(shù)量及活力均明顯優(yōu)于相應(yīng)的微載體靜置單培養(yǎng)組及雙向反應(yīng)器單培養(yǎng)組。生長曲線結(jié)果顯示,微載體靜置單培養(yǎng)組、微載體靜置共培養(yǎng)組、雙向反應(yīng)器單培養(yǎng)組及雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組四組肝細胞密度均為先升高后逐漸下降,四組分別于第3天、第4天、第5天及第5天達

19、峰值:8.22±0.60×105/ml、13.80±1.12×105/ml、32.62±2.51×105/ml和39.38±3.67×105/ml雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組肝細胞峰值密度明顯高于其它三組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。微載體靜置共培養(yǎng)組肝細胞密度于第3至7天均明顯高于微載體靜置單培養(yǎng)組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組肝細胞密度于第2至7天均明顯高于雙向反應(yīng)器單培養(yǎng)組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05

20、)。雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組肝細胞密度于第1至7天均明顯高于微載體靜置共培養(yǎng)組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。肝細胞功能結(jié)果顯示,雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組上清尿素、白蛋白峰值濃度明顯高于其它三組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。微載體靜置共培養(yǎng)組上清尿素濃度、白蛋白濃度于第2至7天均明顯高于微載體靜置單培養(yǎng)組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組上清尿素濃度、白蛋白濃度于第2至7天均明顯高于雙向反應(yīng)器單培養(yǎng)組,差異具有統(tǒng)

21、計學意義(P<0.05)。雙向反應(yīng)器共培養(yǎng)組上清尿素濃度、白蛋白濃度于第1至7天均明顯高于微載體靜置共培養(yǎng)組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 研究結(jié)論：
　　 1、人肝細胞、肝星形細胞共培養(yǎng)能進一步提高肝細胞的功能表達、延長細胞生長時間。
　　 2、雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器微載體人肝細胞、肝星狀細胞三維共培養(yǎng)是維持肝細胞大量增殖分化并保持肝細胞功能一種較為理想的體外肝細胞培養(yǎng)模式。
　　

22、第三部分肝細胞規(guī)?；囵B(yǎng)保護液的研制
　　 研究背景：
　　 肝細胞是生物人工肝(BAL)系統(tǒng)的核心。生物人工肝(BAL)對肝功能衰竭病人的肝支持作用完全依賴于所用肝細胞的特異性生物學功能。目前認為,生物人工肝要達到理想支持效果至少需要1010以上數(shù)量級的細胞,而在保障細胞活性的條件下,肝細胞數(shù)量越多,其支持及治療效果將越佳,因此,肝細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為生物人工肝技術(shù)發(fā)展的核心技術(shù)。雖然肝細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已

23、取得了許多重大的進展,如新型生物反應(yīng)器研制及共培養(yǎng)等培養(yǎng)模式優(yōu)化等,但肝細胞在體外大規(guī)模培養(yǎng)過程中仍容易受到氧氣營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足、代謝產(chǎn)物蓄積等各種因素的損傷,從而導致肝細胞的活性及功能下降。
　　 目前研究表明,在肝細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)過程中,各種損傷因素所引起的肝細胞凋亡正是導致肝細胞活性與功能下降的主要原因。為此,本課題擬通過研制肝細胞規(guī)?；囵B(yǎng)保護液,有效減輕規(guī)模化培養(yǎng)中各種培養(yǎng)環(huán)境因素對肝細胞造成的損傷,并抑制肝細胞凋亡

24、的發(fā)生,從而達到進一步提高并維持肝細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的密度和功能狀態(tài)的效果。
　　 研究目的：
　　 研制一種肝細胞規(guī)?；囵B(yǎng)保護液配方,可在同等條件下有效減輕規(guī)模化培養(yǎng)中各種培養(yǎng)環(huán)境因素對肝細胞造成的損傷,以進一步提高肝細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的密度和功能狀態(tài)。
　　 研究方法：
　　 根據(jù)國內(nèi)外研究成果及前期預(yù)實驗,自行研制出肝細胞保護液配方,成分主要包括黃芪、丹參、果糖、胰島素及維生素C等。人肝細胞在RCMW微重

25、力生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)(RCMW組)、RCMW微重力生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)+肝細胞保護液(RCMW保護液組)、雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)(雙向反應(yīng)器組)及雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)+肝細胞保護液(雙向反應(yīng)器保護液組)四種不同培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)7天,通過倒置顯微鏡觀察及MTT染色比較各組肝細胞生長的形態(tài)、細胞活力差異,并通過細胞計數(shù)、培養(yǎng)上清中ALT、AST、白蛋白、尿素等指標測定,比較各組肝細胞數(shù)量和功能情況。以評

26、價上述保護液配方在RCMW及雙向旋轉(zhuǎn)灌注微重力生物反應(yīng)器兩種不同的大體積(500ml)生物反應(yīng)器中的肝細胞保護效果。
　　 計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析,每組不同時間點之間的分析采用單組的重復(fù)測量方差分析,同一時間點的不同組別之間采用單向方差分析,當方差不齊時采用Welch方法。多重比較當方差齊性時采用LSD方法,當方差不齊時采用Tamhane'sT2方法

27、。檢驗水準a=0.05.
　　 研究結(jié)果：
　　 倒置顯微鏡下形態(tài)學及MTT細胞活力染色結(jié)果可見,RCMW保護液組及雙向反應(yīng)器組肝細胞數(shù)量及活力均明顯優(yōu)于相應(yīng)的RCMW組雙向反應(yīng)器組。生長曲線結(jié)果及肝細胞功顯示,RCMW組、RCMW保護液組、雙向反應(yīng)器組及雙向反應(yīng)器保護液組四組肝細胞密度均為先升高后逐漸下降,四組分別于第2天、第4天、第5天及第5天達峰值:8.82±0.59×105/ml、13.60±1.00×105/m

28、l、32.62±2.68×105/ml和39.9±3.08×105/ml。RCMW保護液組細胞密度于第3至7天均明顯高于RCMW組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雙向反應(yīng)器保護液組細胞密度于第2至7天均明顯高于雙向反應(yīng)器組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RCMW保護液組上清尿素、白蛋白濃度于第1至7天均明顯高于RCMW組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雙向反應(yīng)器保護液組上清尿素、白蛋白濃度于第1至7天均明顯高于雙向反應(yīng)

29、器組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而RCMW保護液組ALT、AST濃度于第2至7天均明顯低于RCMW組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雙向反應(yīng)器保護液組ALT、AST濃度于第4至7天均明顯低于雙向反應(yīng)器組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 研究結(jié)論：
　　 本課題組研制的肝細胞規(guī)模化培養(yǎng)保護液,可在同等條件下有效減輕規(guī)?；囵B(yǎng)中各種培養(yǎng)環(huán)境因素對肝細胞造成的損傷,以進一步提高肝細胞規(guī)模化培養(yǎng)的密度