RNF113A在哈薩克族食管鱗癌中的作用及其功能研究.pdf

1、目的：探討環(huán)指蛋白113A（RNF113A）基因參與食管癌細(xì)胞凋亡、增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響及在食管癌中的作用；通過分析哈族食管鱗癌組織中RNF113A表達(dá)水平與食管癌臨床惡性表型間的關(guān)系，為新疆哈薩克族食管癌臨床早期診斷及個(gè)體化治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：1）采用免疫組織化學(xué)法在組織水平檢測(cè)117例哈薩克族食管鱗癌組織及配對(duì)癌旁正常食管組織中RNF113A的表達(dá)，及RNF113A的表達(dá)與p53表達(dá)的關(guān)系；實(shí)時(shí)熒光定量

2、PCR（qRT-PCR）檢測(cè)41例哈族食管鱗癌組織及配對(duì)癌旁正常食管組織RNF113A的mRNA表達(dá)情況。分析RNF113A的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)（患者年齡、性別、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織類型、腫瘤部位）的關(guān)系。分析RNF113A的表達(dá)與哈薩克族食管鱗癌預(yù)后的相關(guān)性；2）針對(duì)RNF113A的cDNA序列，我們合成了小干擾RNA（siRNA）和真核過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）細(xì)胞系；運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)和wes

3、tern-blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染干擾和過表達(dá)載體后RNF113A表達(dá)水平的變化；運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡；運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNF113A干擾和過表達(dá)后對(duì)ESCC細(xì)胞系遷移的變化，運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNF113A干擾或過表達(dá)后ESCC細(xì)胞系侵襲的變化；3）構(gòu)建了RNF113A慢病毒干擾載體，轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RNF113A敲低的Eca109細(xì)胞系。分別將轉(zhuǎn)染有sh-scram

4、ble及sh-RNF113A細(xì)胞及正常培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞接種于裸鼠皮下，構(gòu)建Eca109細(xì)胞裸鼠皮下荷瘤模型，每周稱重1次，并觀察瘤塊的生長(zhǎng)情況。瘤塊長(zhǎng)出后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠瘤塊長(zhǎng)徑（A）及垂直橫徑（B），按公式V=A×B2/2計(jì)算裸鼠腫瘤體積，并繪制腫瘤體積增長(zhǎng)曲線及體質(zhì)量曲線。處死后采用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠瘤塊組織中RNF113A的表達(dá)。
　　結(jié)果：第一部分：免疫組織化學(xué)檢測(cè)RNF113A蛋白表達(dá)情況。

5、在117哈族ESCC組織中，74例（63.25％）RNF113A呈陽性表達(dá)，RNF113A在哈薩克族食管鱗癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，明顯高于配對(duì)癌旁正常食管組織（P=0.000）。RNF113A和p53的表達(dá)在哈族食管鱗癌組織呈顯著正相關(guān)（P=0.035）。qRT-PCR檢測(cè)41例哈族食管鱗癌組織及配對(duì)癌旁正常食管組織RNF113A的mRNA表達(dá)情況，癌組織中表達(dá)量是癌旁正常組織中表達(dá)量均值的2倍。哈族食管癌組織中RNF113A表達(dá)與臨床病理

6、指標(biāo)間的相關(guān)性分析顯示，分化程度（P=0.008）和T分期（P=0.000）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.017）與RNF113A表達(dá)顯著相關(guān)，而RNF113A表達(dá)與性別、年齡、組織類型、腫瘤部位之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kaplan Meier的生存曲線表明，RNF113A陰性表達(dá)的食管癌患者比RNF113A陽性表達(dá)的患者生存期長(zhǎng)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)單因素分析表明RNF113A表達(dá)和T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響哈族ESCC的預(yù)后因素。多因素分析表明R

7、NF113A表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是哈薩克族食管癌患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。第二部分：在體外ESCC細(xì)胞水平，沉默RNF113A基因后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增加，S期細(xì)胞數(shù)顯著減少，G2/M期細(xì)胞顯著減少，抑制增殖；過表達(dá)RNF113A基因后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少，S期細(xì)胞數(shù)變化不明顯，G2/M期細(xì)胞顯著增加，促進(jìn)增殖。RNF113A siRNA轉(zhuǎn)染Eca109及EC9706細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率顯著上升；RNF113A過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，

8、各組間細(xì)胞凋亡率無差異。干擾RNF113A能抑制Eca109、EC9706細(xì)胞的遷移和侵襲能力；過表達(dá)RNF113A能顯著促進(jìn)ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。第三部分：通過人食管癌Eca109細(xì)胞株裸鼠移植瘤動(dòng)物模型的成功建立，結(jié)果顯示sh-RNF113A組裸鼠的瘤塊體積及重量都比對(duì)照組小，說明干擾RNF113A的表達(dá)后減緩了裸鼠的成瘤能力。sh-RNF113A組裸鼠瘤塊組織中RNF113A的蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低，提示RNF113A