新型雙功能金屬螯合劑及在PET成像中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　近年來，放射性藥物的發(fā)展十分迅速，尤其是正電子發(fā)射成像（PET）診斷藥物和放射免疫治療藥物。雙功能金屬螯合劑作為連接放射性金屬核素與功能性配體的紐帶，在放射藥物的研究中發(fā)揮著重要的作用。64Cu和68Ga是科研和臨床中兩種常用的金屬核素，目前已有多種雙功能金屬螯合劑可用于對二者的標(biāo)記。然而這些螯合劑通常需要較為苛刻的標(biāo)記條件，且對放射性金屬的選擇性低，放射比活度低等，嚴(yán)重限制了新型放射性藥物的研究。功能性配體是研究放射

2、藥物的另一個重要的因素。受制于傳統(tǒng)單價的/單靶向和單模態(tài)的分子探針的固有屬性，很難應(yīng)對腫瘤等疾病的復(fù)雜性和多樣性。近年來，多價的和多模態(tài)的新型分子探針由于它們較高的受體親和力和相互補充的成像能力等優(yōu)點而備受關(guān)注。然而它們的制備過程常常涉及到繁雜的保護和脫保護、多次HPLC純化和較低的產(chǎn)率等問題，嚴(yán)重的制約了這些分子探針的應(yīng)用和發(fā)展。
　　針對這些問題，有必要設(shè)計并合成出一些具備標(biāo)記條件溫和，所得標(biāo)記物穩(wěn)定性高、放射比活度高等性質(zhì)的

3、雙功能金屬螯合劑，并以之為平臺應(yīng)用于放射性藥物的研究中，這也是本研究的主要目的之一。本研究另一個主要的期望是設(shè)計并合成出一個基于雙功能金屬螯合劑結(jié)構(gòu)的通用平臺來簡化多價的和多模態(tài)的分子探針的合成過程，從而促進這一領(lǐng)域的發(fā)展。
　　方法:
　　設(shè)計并合成三種基于 NE3TA結(jié)構(gòu)的雙功能螯合劑，并將其與多肽 LLP2A偶聯(lián)并分別進行64Cu和68Ga標(biāo)記，測試其放射比活度、血漿穩(wěn)定性等性質(zhì)。利用LC-MS研究p-NO2-PhPr

4、-NE3TA對Cu2+螯合的選擇性。測試被64Cu和68Ga標(biāo)記的分子探針在B16F10細胞中的攝取及流出情況。建立荷B16F10腫瘤小鼠模型，并將被64Cu和68Ga標(biāo)記的分子探針應(yīng)用于該模型的腫瘤靶向PET/CT顯像。
　　接著設(shè)計并合成具有兩個不同偶聯(lián)功能基團的雙功能金屬螯合劑 NOTA2tBu-N3，然后利用該平臺將靶向uPAR的多肽AE105及靶向整合素αvβ3受體的c(RGDyk)偶聯(lián)，從而制備具有不同長度PEG連接基

5、團的多肽異源二聚體分子探針。將各異源二聚體分子探針進行64Cu標(biāo)記后，通過細胞實驗，篩選出一個性質(zhì)較好的多肽異源二聚體分子探針，并應(yīng)用于荷U87MG腫瘤小鼠的PET/CT成像。其結(jié)果與它相應(yīng)的單聚體分子探針64Cu-AE105及64Cu-RGD的成像結(jié)果進行比較。另外，利用NOTA2tBu-N3為平臺，通過點擊化學(xué)或者固相合成的方法制備其他類型的分子探針，比如多肽同源二聚體和PET/光學(xué)多模態(tài)分子探針等。
　　結(jié)果:
　　即

6、使在十倍量Fe(III)存在的情況下，p-NO2-PhPr-NE3TA依然能優(yōu)先與Cu(II)進行螯合，顯示出對Cu(II)較高的選擇性。其多肽偶聯(lián)物NE3TA-LLP2A可在室溫下被64Cu標(biāo)記，并具備良好的血漿穩(wěn)定性，同時其放射性比活度值達3~4 mCi/nmol，遠高于NOTA-LLP2A的~1 mCi/nmol。雖然所合成的另外兩個雙功能金屬螯合劑與64Cu的標(biāo)記結(jié)果不理想，但 p-SCN-PhPr-NE2P1A表現(xiàn)出優(yōu)秀的68

7、Ga標(biāo)記屬性。其偶聯(lián)物NE2P1A-LLP2A可在室溫、中性的pH下在15 min內(nèi)完成68Ga標(biāo)記，且具備較好的血漿穩(wěn)定性；而在相同的條件下NOTA-LLP2A的68Ga標(biāo)記率低。
　　64Cu-NE3TA-LLP2A和68Ga-NE2P1A-LLP2A在荷B16F10小鼠的生物分布結(jié)果類似，均在腫瘤部位有較高的攝取,且腫瘤/肌肉比值高。64Cu-NE3TA-LLP2A的腫瘤/肌肉比值在2 h，4 h和24 h分別達到5.81±

8、0.99、10.50±2.02和25.19±7.78。68Ga-NE2P1A-LLP2A的腫瘤/肌肉的比值在1 h，2 h和4 h分別達到6.66±1.87、10.62±2.98和10.25±1.45。將二者用于同一腫瘤模型的PET/CT成像中時，在注射64Cu-NE3TA-LLP2A后的2 h，4 h和注射68Ga-NE2P1A-LLP2A后的1 h，2 h均能明顯分辨出腫瘤。同時注射了阻斷劑量的LLP2A的阻斷組小鼠的生物分布及PE

9、T/CT成像均充分體現(xiàn)了B16F10腫瘤對LLP2A攝取的特異性。
　　利用 NOTA2tBu-N3平臺，方便地合成出四個多肽異源二聚體分子探針AE105-PEGn-NOTA-PEG4-RGD（n=0，4，8，12，分別簡寫為T1，T2，T3，T4），一個多肽同源二聚體分子探針(AE105-NOTA-PEG4-AE105)及兩個PET/光學(xué)雙模態(tài)分子探針(AE105-NOTA-nonclick-Cy3和AE105-NOTA-cli

10、ck-Cy5)。所有分子探針均能與64Cu在放射比活度~1 mCi/nmol下進行標(biāo)記，且標(biāo)記后在人血漿中穩(wěn)定性較好。細胞實驗表明，隨著PEG鏈的增長，各分子探針在U87MG細胞中的攝取率有逐漸增加的趨勢，順序為T4>T3>T2≥T1，而與U87MG細胞結(jié)合的穩(wěn)定程度順序為T3>T2≥T1>T4。在荷U87MG裸鼠模型的生物分布試驗中，64Cu-T3在腫瘤組織中攝取比較高，其腫瘤/肌肉比值在1 h，4 h，24 h分別為4.37±1.4

11、6,12.69±3.08，和15.47±3.32。PET/CT成像實驗結(jié)果顯示，64Cu-T3在腫瘤中的攝取率顯著高于64Cu-RGD和64Cu-AE105。64Cu-T3的腫瘤/肌肉比值顯著高于64Cu-AE105，與64Cu-RGD接近。
　　結(jié)論及創(chuàng)新點:
　　設(shè)計并合成了多個新穎的雙功能螯合劑，其中成功 p-SCN-PhPr-NE3TA表現(xiàn)出對Cu(II)較高的選擇性，且與64Cu標(biāo)記的條件溫和，放射比活度高。所合成

12、的p-SCN-PhPr-NE2P1A是一個很好的68Ga螯合劑，可以應(yīng)用于溫度和酸敏感的生物分子的68Ga標(biāo)記。64Cu-NE3TA-LLP2A和68Ga-NE2P1A-LLP2A均對B16F10腫瘤具有出色的靶向性，在黑色素瘤的診斷中具有很好應(yīng)用前景。
　　我們也成功的合成了一個基于雙功能螯合劑結(jié)構(gòu)的合成平臺，可極大的簡化多肽異源二聚體等分子探針制備過程。與其它平臺比較，我們所合成的這個平臺具有多重優(yōu)勢，包括簡單的合成（無需大量

13、的保護和脫保護及反應(yīng)條件優(yōu)化過程）、簡單的純化過程（需要更少的或只需一次色譜分離），更高的產(chǎn)率。更重要的是，這個平臺還可以用于制備多肽同源二聚體、PET/光學(xué)雙模態(tài)等分子探針，用途廣泛。多肽異源二聚體分子探針64Cu-T3展示了比其單聚體分子探針更高的腫瘤攝取率以及更好的體內(nèi)腫瘤成像效果。總而言之，這個平臺提供了一條通用和可靠的方法用于制備多模式的分子探針，并且可以作為一個模塊化的平臺用于多模式分子探針的結(jié)構(gòu)優(yōu)化或者日常的臨床前/臨床研