冷哮丸對哮喘豚鼠模型作用機制的實驗研究.pdf

1、1目的：
　　 本課題以卵蛋白(OVA)致敏和攻擊復制豚鼠哮喘模型，探討冷哮丸對豚鼠哮喘模型在乙酰膽堿(Ach)激發(fā)后所致呼氣阻力和氣管螺旋條對組織胺反應性的影響；外周血和肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞(EOS)數(shù)量、肺組織形態(tài)學觀察；以及對血清免疫球蛋白E(IgE)，血清和BALF中IL-4、IL-5、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)等指標的影響，從免疫反應、氣道炎癥反應、氣道重塑和氣道反應性等方面探討該方的平喘

2、作用機制。
　　 2方法：
　　 2.1材料
　　 2.1.1實驗動物：普通級豚鼠60只，雄性，體重250±50g，湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。
　　 2.1.2藥劑制備：冷哮丸由麻黃、生川烏、細辛、蜀椒、白礬、牙皂、半夏曲、陳膽星、杏仁、甘草、紫菀、款冬花共12味中藥組成，按1:1：1:1:1:1:1:1:1:1:2:2比例，加10倍量的水煎煮2h，醫(yī)

3、用紗布過濾，濾渣加入6倍量的水煎煮1h，過濾，兩次濾液合并，低溫放置24h，過濾并水浴濃縮至原生藥含量1.6g/ml，置低溫冰箱中(4℃)備用。由湖北中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂制劑室制備。地塞米松片，0.75mg/片。臨用時以蒸餾水稀釋至相應藥物濃度灌胃。劑量：地塞米松1mg/kg；中藥冷哮丸小劑量組4mg/kg；中藥冷哮丸中劑量組8mg/kg；中藥冷哮丸大劑量組16mg/kg。
　　 2.1.3主要試劑：卵白蛋白(OVA)，Sigma公

4、司；乙酰膽堿，上?？曝S化學試劑責任公司；磷酸組胺，上海喜潤化學工業(yè)有限公司；IgE放免試劑盒，北方生物技術研究所生產(chǎn)；NO測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；豚鼠IL-4試劑盒，豚鼠IL-5試劑盒，深圳晶美生物工程有限公司；ET-1放免試劑盒，北京東亞放射免疫所。
　　 2.1.4主要儀器：JSC-OK雙頭式多功能型超聲波霧化器；RJE壓力換能器；LMS-2B型二道生理記錄儀；DH-140型動物人工呼吸機；ThermoLabsy

5、stemsMultiskan MK3酶標分析儀；722型光柵分光光度計；Olympus BX50F-3雙顯微鏡(含自動照相裝置Nikon E990)；VEX380型-80℃低溫冰箱。
　　 2.2方法
　　 2.2.1動物模型復制
　　 以卵蛋白致敏和攻擊復制豚鼠哮喘模型。實驗第1天，配制100g/L卵蛋白生理鹽水，豚鼠腹腔注射1ml卵蛋白生理鹽水以致敏；第15天將致敏豚鼠置于15升透明玻璃罩內(nèi)，給予1％卵蛋白生

6、理鹽水霧化吸入。以后每隔24h以1％卵蛋白生理鹽水誘喘，共4次。正常對照組用同樣方法以等量生理鹽水進行腹腔注射及霧化吸入。
　　 2.2.2動物分組
　　 將豚鼠隨機分為6組：①正常對照組，②哮喘模型組，③西藥對照組(地塞米松治療組)，④冷哮丸大劑量組，⑤冷哮丸中劑量組，⑥冷哮丸小劑量組，每組10只。
　　 2.2.3實驗檢測項目
　　 2.2.3.1實驗一冷哮丸對哮喘豚鼠氣道反應性的影響。①一般情況觀察

7、：包括各組豚鼠的行為、飲食、體重、排便、皮毛及死亡等情況。②乙酰膽堿(Ach)支氣管激發(fā)試驗：于第23 d治療結(jié)束后2h，用3％戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，仰面固定于木板上，切開頸部皮膚暴露頸靜脈及氣管，用靜脈留置針行頸外靜脈穿刺置管，行氣管切開、氣管插管，連DH-140型動物人工呼吸機行輔助通氣。每只豚鼠分別給予成倍增加的乙酰膽堿(0、12.5、25、50、100、200μ g/kg)，每次進液量200μl，兩個相鄰給藥點

8、間隔5min。采用AniRes2003動物肺功能分析系統(tǒng)連續(xù)動態(tài)測定呼氣阻力(expiratory resistance，Re)，計算各給藥時間點的Re與基礎的Re比值(以百分數(shù)表示)，以Re的變化代表氣道反應性。③組織胺氣道反應性測定：豚鼠麻醉后，縱向剪開頸部皮膚及皮下組織，暴露氣管，取中段氣管軟骨環(huán)，剪開形成3 mm寬的氣管螺旋條。用細線將螺旋條一端固定于浴槽底部，另一端連與壓力換能器。對螺旋條施以2 g的起始張力，平衡1 h后，間

9、隔2-3min依次加入10-6-10-3mol/L的組織胺進行刺激，連續(xù)記錄氣管螺旋條的張力變化。
　　 2.2.3.2實驗二冷哮丸對哮喘豚鼠外周血和BALF中EOS數(shù)量及肺組織形態(tài)學的影響。于第23d麻醉動物，分離頸動脈，取頸動脈血1ml作白細胞分類和EOS計數(shù)。其余全血離心，取血清，放置-20℃低溫冰箱中保存待檢。對采血后的豚鼠進行肺泡灌洗，并回收肺泡灌洗液(BALF)，瑞氏染色后行EOS計數(shù)，肉眼及光鏡觀察豚鼠肺組織形態(tài)學

10、變化。
　　 2.2.3.3實驗三、四、五冷哮丸對哮喘豚鼠血清總IgE、血清和BALF中NO、IL-4、IL-5、ET-1的影響。按豚鼠IgE、NO、IL-4、IL-5、ET-1等相關試劑盒說明進行操作測定。
　　 2.3統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3結(jié)果：
　　 3.1實驗一：冷哮丸對哮喘豚鼠氣

11、道反應性的影響
　　 3.1.1一般情況結(jié)果：正常對照組豚鼠無任何不適反應，平均體重增加，毛色光澤。哮喘模型組豚鼠普遍精神較差，活動減少，反應遲鈍，進食及飲水量明顯下降，毛色失去光澤，出現(xiàn)不同程度的呼吸次數(shù)增加，張口等呼吸困難癥狀，在整個喂養(yǎng)過程中體重增加不明顯。哮喘模型組1只豚鼠哮喘嚴重發(fā)作經(jīng)搶救無效死亡。各用藥組豚鼠情況均較哮喘模型組明顯改善。
　　 3.1.2各組豚鼠在不同濃度Ach激發(fā)后Re增長率比較：在Ach濃

12、度為50μ g/kg、100μg/kg、200μg/kg時，哮喘模型組Re的增長率與正常對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在Ach濃度為50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg時，地塞米松治療組、冷哮丸大、中、小劑量組與哮喘模型組Re的增長率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。地塞米松治療組與冷哮丸大劑量組之間，及其與正常對照組之間Re的增長率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

13、　　 3.1.3各組豚鼠氣管螺旋條對組織胺的反應性比較：當浴槽中組織胺濃度達到10-5-10-3mol/L時，各組豚鼠氣管螺旋條產(chǎn)生劑量依賴性收縮。哮喘模型組豚鼠氣管螺旋條張力明顯高于正常對照組(P<0.05)。地塞米松治療組和冷哮丸大、中、小劑量組哮喘豚鼠的氣管螺旋條對組織胺的反應性均降低，各個濃度組織胺所誘導的氣管螺旋條收縮張力與正常組類似(P>0.05)。
　　 3.2實驗二冷哮丸對哮喘豚鼠外周血和BALF中EOS數(shù)量及

14、肺組織形態(tài)學的影響
　　 3.2.1冷哮丸對豚鼠血及BALF中EOS計數(shù)的影響
　　 各組豚鼠血及BALF中EOS計數(shù)結(jié)果表明：正常對照組豚鼠血及BALF中白細包總數(shù)(white blood-cell count，WBC)、EOS絕對值及百分比均較低，模型組豚鼠血及BALF中WBC、EOS絕對值及百分比顯著增加，與正常組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)果表明，哮喘可引起實驗豚鼠外周血及BALF中炎性細胞總數(shù)

15、，尤其是EOS增多，這是氣道炎癥反應的病理學基礎。治療組各組動物外周血和BALF中自細胞總數(shù)、EOS數(shù)與哮喘模型組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中地塞米松組和冷哮丸大劑量組EOS數(shù)與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而冷哮丸中、小劑量組EOS數(shù)與正常對照組比較，差異仍有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明冷哮丸能較好地控制哮喘的氣道炎癥性反應，而且存在劑量依賴關系。
　　 3.2.2肺組織肉眼觀察<

16、br>　　 正常對照組：肺組織呈淡紅色，表面光滑，組織柔軟富有彈性。哮喘模型組：肺組織呈暗紅色，表面呈顆粒狀，組織膨脹明顯，部分組織顏色加深。藥物治療各組肺組織介于前二者之間。
　　 3.2.3肺組織HE染色光鏡觀察
　　 正常對照組：豚鼠肺組織支氣管黏膜上皮排列整齊，黏膜下層及外膜層次清楚，無炎癥反應，管腔清潔完整無分泌物。哮喘模型組：支氣管黏膜上皮可見局灶性脫落，黏膜下層明顯充血水腫，EOS灶狀浸潤，內(nèi)夾少許淋巴細

17、胞、漿細胞。高倍鏡下見黏膜杯狀細胞增生，數(shù)量增多，平滑肌增生肥大。黏膜下層炎癥細胞灶狀浸潤。地塞米松組：支氣管管壁結(jié)構完整，黏膜上皮部分恢復正常，黏膜下層輕度充血水腫，管腔未見分泌物。冷哮丸大劑量組：支氣管管壁結(jié)構基本完整，黏膜上皮部分恢復正常，黏膜下層水腫明顯減輕，支氣管管腔恢復正常，未見炎性滲出物。冷哮丸中劑量組：管腔內(nèi)見少許脫落的上皮細胞，粘膜增生，基層輕度肥厚。黏膜下層見輕度充血水腫及少量炎癥細胞，管腔內(nèi)仍見炎性滲出物。冷哮丸小

18、劑量組：支氣管管壁結(jié)構層次清楚，黏膜上皮逐漸恢復，管腔內(nèi)可見部分炎性滲出物。
　　 3.3實驗三冷哮丸對哮喘豚鼠血清總IgE、血清和BALF中NO的影響
　　 3.3.1冷哮丸對哮喘豚鼠血清IgE含量的影響
　　 與正常對照組比較，哮喘模型組豚鼠血清總IgE含量升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各治療組血清總IgE含量較模型組均明顯降低(P<0.01)，各治療組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。<

19、br>　　 3.3.2冷哮丸對哮喘豚鼠血清和BALF中NO含量的影響
　　 哮喘模型組血清和BALF中NO含量明顯升高，與正常對照組相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。給予地塞米松或不同劑量冷哮丸經(jīng)治療后，血清和BALF中NO含量均明顯降低，與哮喘模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)。但治療后，冷哮丸中、小劑量組血清和BALF中NO含量與正常對照組相比，差異仍有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

20、>　　 3.4實驗四冷哮丸對哮喘豚鼠血清和BALF中IL-4、IL-5的影響
　　 3.4.1冷哮丸對哮喘豚鼠血清和BALF中IL-4含量的影響
　　 哮喘模型組豚鼠血清和BALF中IL-4含量明顯升高，與正常對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各治療組豚鼠血清血清和BALF中IL-4含量明顯下降，與哮喘模型組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 3.4.2冷哮丸對哮喘豚鼠血清和B

21、ALF中IL-5含量的影響
　　 哮喘模型組豚鼠血清和BALF中IL-5含量明顯升高，與正常對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各治療組豚鼠血清和BALF中IL-5含量明顯下降，與哮喘模型組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 3.5實驗五冷哮丸對哮喘豚鼠血清和BALF中ET-1的影響
　　 3.5.1冷哮丸對哮喘豚鼠血清和BALF中ET-1含量的影響
　　 哮喘模型組豚鼠血

22、清和BALF中ET-1含量明顯升高，與正常對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各治療組豚鼠血清和BALF中ET-1含量明顯下降，與哮喘模型組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，各治療組間血清和BALF中ET-1含量比較，差異無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 3.5.2對氣道重塑的影響
　　 哮喘豚鼠支氣管黏膜上皮局灶性脫落，黏膜下層明顯充血水腫，EOS等炎癥細胞灶狀浸潤，黏膜杯狀細胞增生，

23、數(shù)量增多，平滑肌增生肥大，顯示哮喘模型組出現(xiàn)氣道重塑病理改變。經(jīng)冷哮丸治療后，豚鼠的氣道黏膜下層充血水腫，杯狀細胞增生、平滑肌增生肥大等氣道重塑病理也明顯改善。
　　 4結(jié)論：
　　 4.1以卵蛋白致敏加攻擊方法，可以誘發(fā)豚鼠氣道變態(tài)反應，成功復制哮喘豚鼠模型。
　　 4.2實驗證實哮喘發(fā)病與風、寒、痰等密切相關。宿痰伏肺，遇寒觸發(fā)，致氣道攣急是哮喘發(fā)作的主要病機。
　　 4.3冷哮丸有溫肺散寒，滌痰化飲

24、，解痙平喘之功，對哮喘豚鼠有良好的治療效果，其作用機制是多途徑、多層次、多靶點綜合作用的結(jié)果。
　　 4.3.1冷哮丸能明顯抑制哮喘模型Ⅰ型變態(tài)反應。作用機制與冷哮丸降低血清總IgE含量，下調(diào)IL-4、IL-5水平，抑制過敏介質(zhì)的釋放密切相關。
　　 4.3.2冷哮丸能有效控制哮喘豚鼠模型的氣道炎癥反應，作用機制與冷哮丸降低血及BALF中炎性細胞數(shù)量，減輕炎癥浸潤，并降低血清和BALF中IL-4、IL-5、NO水平有關。