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文檔簡介
1、在真核細胞中,胞吞途徑中區(qū)室化形態(tài)結(jié)構(gòu)是胞吞分子胞內(nèi)分選轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而區(qū)室化形態(tài)結(jié)構(gòu)之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運和信息交流依賴于囊泡的形成與轉(zhuǎn)運。早期內(nèi)涵體(early endosome,EE)作為胞吞途徑中高度動態(tài)的區(qū)室化形態(tài)結(jié)構(gòu),是胞吞貨物的分選平臺。EE通過高度動態(tài)的管狀結(jié)構(gòu)進行貨物蛋白的循環(huán)轉(zhuǎn)運,或通過膜內(nèi)陷形成腔內(nèi)囊泡將胞吞貨物轉(zhuǎn)運到溶酶體中進行降解。胞吞物質(zhì)在EE上的分選與轉(zhuǎn)運是一個復(fù)雜而又精細的過程,需要多種蛋白和脂質(zhì)的參與,它們共
2、同調(diào)控EE上胞吞物質(zhì)的分選與轉(zhuǎn)運囊泡的形成。前期研究表明,在哺乳動物細胞中,ACTIN與EE上物質(zhì)的分選和轉(zhuǎn)運囊泡的形成密切相關(guān)。然而,ACTIN在轉(zhuǎn)運囊泡形成過程中膜的重塑,主要包括膜的成管和剪切作用機制仍不清楚。
鑒于此,在本研究中,不同種屬哺乳動物細胞COS-7和HeLa細胞作為研究載體;借助熒光標記和激光共聚焦熒光顯微成像技術(shù),觀察ACTIN在COS-7和HeLa細胞內(nèi)涵體/溶酶體系統(tǒng)上的定位情況。為了觀察ACTIN和
3、其調(diào)控因子WASH在EE上轉(zhuǎn)運囊泡形成中的動態(tài)行為,在COS-7細胞上瞬時表達常激活型熒光標簽RAB5蛋白(RAB5 Q79L)和LifeAct-mKate2或GFP-WASH;由于表達RAB5 Q79L,造成EE發(fā)生同源融合,從而形成空泡結(jié)構(gòu),形成的空泡結(jié)構(gòu)有利于在熒光顯微鏡分辨率有限的情況下觀察EE上的動態(tài)事件。通過藥物處理抑制ACTIN動態(tài)組裝實驗探索了ACTIN在EE上轉(zhuǎn)運囊泡形成過程中的具體作用機制;同時也借助藥物處理實驗進一
4、步探究了ACTIN功能缺陷對轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,Tfn)和10 KDa Dextran在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的影響。最后,借助熒光三標記和活細胞實時成像技術(shù),初步探索了ACTIN和WASH在EE上轉(zhuǎn)運囊泡形成事件中兩者在動態(tài)行為上的相關(guān)性。
ACTIN胞內(nèi)定位研究數(shù)據(jù)顯示,ACTIN在COS-7和HeLa細胞中的定位呈現(xiàn)高度一致性,主要分布在EE上,在循環(huán)內(nèi)涵體(recycling endosomes,RE)上有少量數(shù)量上的
5、分布,且以離散型ACTIN微域的形式分布在EE膜上。熒光標記活細胞實時成像實驗數(shù)據(jù)表明,在COS-7細胞中,ACTIN和WASH與EE上轉(zhuǎn)運囊泡的形成密切相關(guān)。COS-7上藥物處理實驗表明,當使用Latrunculin B抑制ACTIN動態(tài)組裝時,會造成EE上可能由于剪切功能缺陷而出現(xiàn)長膜管狀結(jié)構(gòu);同時在HeLa細胞上藥物處理實驗表明,ACTIN功能缺陷會影響Tfn和10 KDa Dextran胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,造成Tfn和10 KDa Dex
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