Microbial diversity in acid mine drainage at Tong Lushan Copper Mine.pdf

1、中南大學(xué)碩士學(xué)位論文MicrobialdiversityinacidminedrainageatTongLushanCopperMine姓名：霍強(qiáng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物工程指導(dǎo)教師：劉新星20070101硝士學(xué)柱論毫土壤DNA提取方法提取酸性礦坑水濾泥以及底泥的基因組，并將基因組進(jìn)行純化。其次，利用細(xì)菌通用引物63F(5’CAGGCCTAACACATGCAAGTC3’)及1387R(5’GGCJCGGWGTGTACAAGGC一3’

2、1和古菌通用引物s—nArch0344aS20(5ACGGGGCGCAGCAGGCGCGA3’)及SUniv1517aA21f5ACGGCTACCTTGTrACGACTI3)對(duì)純化后的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增到的產(chǎn)物進(jìn)行純化。然后，將純化后的PCR產(chǎn)物連接到載體上并克隆到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。然后，通過藍(lán)白篩選挑取陽性克隆子，在999℃對(duì)陽性克隆子進(jìn)行破壁，利用載體引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后，在37℃利用DNA限制性內(nèi)切酶Hin

3、PlI和Mspl對(duì)得到的陽性克隆子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切時(shí)間為舢5個(gè)小時(shí)。酶切后，將酶切后的產(chǎn)物于80V、3％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析凝膠電泳圖中的電泳條帶的差異。分析后，選取特異性凝膠電泳條帶所對(duì)應(yīng)的克隆子，并將克隆子進(jìn)行測(cè)序列測(cè)定。最后，將得到的序列與已知序列進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，同時(shí)結(jié)合樣地物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)酸性礦坑水及底泥中的微生物群落組成及差異性進(jìn)行分析。樣地的地理化學(xué)特性結(jié)果顯示tlsl和tsl2酸

4、性礦坑水中的離子濃度較高，其中tlsl中的鐵元素的含量較高，tls2中的銅元素的含量較高，兩樣地的口H值均較低，分別為21和23，；tls3中的離子濃度較低，口H值較高，為54。樣地的地理化學(xué)特性的主要成份分析(PCA)顯示flsl和tsl2的地理化學(xué)特性比較相似，而tb3與前兩者的地理化學(xué)特性相差較大；三樣地間的pH、銅、亞鐵、全鐵的含量有較大的差異，其余元素含量差異不大。限制性酶切片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析顯示flsl、tls2、fls3三

5、個(gè)樣地的細(xì)菌16SrDNA克隆文庫中分別只有14、“、19種操作分類單元(OTUs，即RFLP條帶類型)；fls2古菌16SrDNA克隆文庫中有6種操作分類單元；tls2的酸性礦坑水下的底泥中的細(xì)菌16SrDNA克隆文庫中有12種操作分類單元。共測(cè)定了62個(gè)克隆子的序列，這些序列與當(dāng)前數(shù)據(jù)庫(GenBank)中已有序列的相似性在89％99％之間。將測(cè)定得到的序列與某些己知細(xì)菌序列進(jìn)行行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，tim中酸性礦坑