高糖對HRPE細(xì)胞氧化應(yīng)激和MMP-2,MMP-9表達(dá)的影響以及α-硫辛酸的干預(yù)作用.pdf

1、目的：糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，而且是全世界范圍內(nèi)成人導(dǎo)致視力下降，甚至失明的主要因素之一。DR最常見的是黃斑變性和增殖性視網(wǎng)膜病變。隨著病程進(jìn)展，幾乎所有的1型糖尿病和一半以上的2型糖尿病患者均有不同程度的視網(wǎng)膜病變，嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量。DR的發(fā)病機(jī)制主要有蛋白激酶(protein kinase，PKC)的激活，糖基化終末產(chǎn)物的堆積，多元醇代謝通路異

2、常，氧化應(yīng)激學(xué)說，炎癥反應(yīng)，多種細(xì)胞因子參與等等。氧化應(yīng)激學(xué)說是目前比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制之一，而且趨向認(rèn)為氧化應(yīng)激很可能是上述機(jī)制的始動因素。高糖刺激下氧自由基清除能力下降，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物堆積，在視網(wǎng)膜組織表現(xiàn)尤為突出。氧化應(yīng)激可能引起PKC激活，糖基化產(chǎn)物增加，多元醇通路等多條代謝途徑異常。近年來，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metaloproteinases，MMPs)與視網(wǎng)膜病變之間的關(guān)系也成為研究熱點。MMPs是依賴Zn2+的蛋白

3、水解酶家族，其生物學(xué)作用主要是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解。DR的基本的病理機(jī)制就是新生血管的生成，而這一過程的的前提是視網(wǎng)膜基底膜和ECM的降解，周細(xì)胞的遷移。血管基底膜最主要的膠原成分是Ⅳ型膠原，MMP-2，MMP-9是降解Ⅳ型膠原最關(guān)鍵的明膠酶。國內(nèi)外研究，不管是DR患者的臨床試驗，糖尿病動物模型，還是高糖下培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞均證實MMP-2，MMP-9表達(dá)活性的增加。說明MMPs在DR的發(fā)

4、病過程中起到了重要的作用。但是高糖刺激MMPs活性增加的具體機(jī)制尚未明確。而硫辛酸作為應(yīng)用廣泛作用較強(qiáng)的抗氧化劑，在視網(wǎng)膜細(xì)胞也無一例外。國內(nèi)已有研究，將50μl的丙烯醛作用于人視網(wǎng)膜色素上皮(human retinalpigment epithelial，HRPE)細(xì)胞造成氧化損傷，觀察不同濃度的硫辛酸的干預(yù)作用，結(jié)果證明一定濃度的硫辛酸對其有保護(hù)作用。本實驗通過不同濃度的硫辛酸作用于高糖體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞48小時，觀察MMP-2，

5、MMP-9的表達(dá)活性及氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，探討高糖引起MMPs表達(dá)變化的機(jī)制以及硫辛酸的保護(hù)作用，有可能為尋找DR的預(yù)防和治療找到新的途徑。
　　方法：體外培養(yǎng)HRPE細(xì)胞，選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細(xì)胞入組。實驗分為八組：正常對照組(glucose5.56 mmol/L，DMEM培養(yǎng)液)，高糖組(glucose30 mmol/L，DMEM培養(yǎng)液)，五個藥物干預(yù)組：(α-硫辛酸濃度分別為10μmol/L、50μmol/L、100μm

6、ol/L、200μmol/L、300μmol/L加入glucose30 mmol/L，DMEM培養(yǎng)液)，甘露醇組(mannitol30 mmol/L)，培養(yǎng)48小時，觀察HRPE細(xì)胞的形態(tài)，MTT法檢測生存活力，比色法檢測過氧化物酶(SOD)，還原性谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)，Western Blot檢測MMP-2，MMP-9蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.與正常對照組相比，高糖組的SOD，GSH表達(dá)活性均明顯減

7、低，MDA含量明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。甘露醇組則變化不明顯(P>0.05)。
　　加入硫辛酸干預(yù)，SOD，GSH的表達(dá)活性增加，MDA含量減少，除10μmol/L組外，其余各組均較高糖組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，呈劑量依賴性。并且藥物劑量組間比較可知，除硫辛酸100，200μmol/L組外，其余任意兩組的MDA的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；硫辛酸300μmol/L組較硫辛酸50，100，200μmol/L

8、組的SOD活性均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；GSH則無明顯的組間差異(P>0.05)。
　　2.與正常對照組相比，高糖組的MMP-2，MMP-9的蛋白表達(dá)量均顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。甘露醇組則無明顯變化(P>0.05)。
　　加入硫辛酸干預(yù)，MMP-2，MMP-9的蛋白表達(dá)量均有所下降，除10μmol/L組外，其余各組均較高糖組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，呈劑量依賴性。藥物劑量組間比較可知，任意兩組不同的

9、濃度MMP-2的表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；MMP-9的蛋白表達(dá)則無明顯的組間差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.高糖環(huán)境可以引起視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，以及MMP-2，MMP-9的表達(dá)活性增加，可能在糖尿病視網(wǎng)膜病變的過程中發(fā)揮重要作用。
　　2.高糖可能通過刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激上調(diào)MMP-2，MMP-9的表達(dá)，氧化應(yīng)激可能是一個中介因素。
　　3.一定藥物濃度的α-_硫辛酸可以