基于微納熱電偶探極的單細(xì)胞測(cè)溫研究.pdf

1、細(xì)胞是生命體的最小結(jié)構(gòu)和功能單位，細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、新陳代謝，都從一個(gè)側(cè)面反應(yīng)生命體的生命狀態(tài)和健康程度。對(duì)單個(gè)細(xì)胞的研究不僅有利于解釋細(xì)胞及生物體的生理活動(dòng)，而且有利于研究疾病的發(fā)病與治療機(jī)理。生化指標(biāo)和理化性質(zhì)是單細(xì)胞檢測(cè)的重要研究對(duì)象，它可以揭示不同細(xì)胞在各種蛋白表達(dá)、pH值、溫度、酶活性等方面的差異性，有利于疾病的早期診斷。
　　環(huán)境溫度參數(shù)是細(xì)胞生存、增殖的重要參數(shù)，環(huán)境溫度的高低直接影響細(xì)胞新陳代謝的進(jìn)程。反過(guò)來(lái)看，細(xì)

2、胞的新陳代謝包含了物質(zhì)代謝和能量代謝，細(xì)胞內(nèi)的各種活動(dòng)，包括原料組裝成大分子，廢棄物的產(chǎn)生和排放，遺傳信息的傳遞，泵離子跨膜運(yùn)輸?shù)?，都必須獲取和消耗能量。而能量在轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，必然伴隨著熱能產(chǎn)生。這些熱能的產(chǎn)生可能會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境溫度。因此，單細(xì)胞溫度測(cè)量可能為了解細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)及生物過(guò)程提供新的研究手段。
　　然而，細(xì)胞具有尺寸小、胞內(nèi)組分復(fù)雜、被測(cè)組分含量很低、隨外界環(huán)境(如溶液組分、溫度、pH)而發(fā)生變化等特點(diǎn)。這些特

3、點(diǎn)對(duì)單細(xì)胞操縱、環(huán)境控制及探測(cè)靈敏度等方面提出了很高的要求。因此，實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)溫度的測(cè)量，需要研究和開發(fā)與單個(gè)細(xì)胞尺寸相匹配、高靈敏度的溫度傳感器。目前世界范圍內(nèi)，測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的溫度還沒有成熟的技術(shù)和儀器，一些研究還處于起步階段。因此，本論文設(shè)計(jì)制作了基于熱電偶原理的微納測(cè)溫探極，并用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的溫度變化。
　　論文第二章設(shè)計(jì)并制作了可以穿刺進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的微納熱電偶測(cè)溫探極，其測(cè)溫端尺寸可達(dá)亞微米級(jí)乃至納米級(jí)。在第三章中，對(duì)微納

4、熱電偶探極進(jìn)行溫度定標(biāo)，以此建立電壓信號(hào)與溫度信號(hào)的函數(shù)關(guān)系。建立了單細(xì)胞測(cè)溫系統(tǒng)，通過(guò)絕熱屏蔽裝置，將環(huán)境溫度變化控制在0.15℃范圍內(nèi)；通過(guò)使用微納熱電偶探極的操控單元的可以精確控制探極的穿刺細(xì)胞，分辨率達(dá)到50nm，最大穿刺速度達(dá)360mm/s；通過(guò)對(duì)信號(hào)的采集處理，得到了較高的溫度分辨率，達(dá)到0.06℃(時(shí)間分辨率為0.1s)和0.2℃(時(shí)間分辨率為0.001s)本論文第四章使用建立的細(xì)胞測(cè)溫系統(tǒng)，在不同濃度、不同種類的抗癌藥物

5、作用下，對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)溫度信號(hào)變化進(jìn)行了初步研究，可能為抗癌藥物篩選提供新的方法。
　　論文的主要研究?jī)?nèi)容及取得的研究成果如下：
　　1.設(shè)計(jì)單細(xì)胞測(cè)溫探極結(jié)構(gòu)
　　基于適合細(xì)胞測(cè)溫的原則設(shè)計(jì)探極結(jié)構(gòu)：探極的尖端尺寸需盡量小，以便插入細(xì)胞內(nèi)部，末端尺寸必須有利于探極的固定和信號(hào)的采集。因此，錐形作為測(cè)溫探極的形狀是較為合適的。根據(jù)熱電偶測(cè)溫的原理，兩種不同材質(zhì)的金屬接觸才能形成測(cè)溫結(jié)。因此，在錐形結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，

6、設(shè)計(jì)了同軸的三層結(jié)構(gòu)，由內(nèi)而外分別為探極的基極、介質(zhì)層和外極。其中探極的基極為錐形，且只有尖端與外極連接，基極的其余部分被介質(zhì)層所包覆，不與外極接觸，基極與外極的接觸部分形成微納尺寸的測(cè)溫結(jié)。
　　2.成功制備微納熱電偶測(cè)溫探極并對(duì)測(cè)溫探極進(jìn)行溫度定標(biāo)
　　為了兼顧微納熱電偶探極的機(jī)械強(qiáng)度、熱電動(dòng)勢(shì)和生物相容性，選擇鉑、鎢和聚氨酯作為探極制備材料。使用了電化學(xué)腐蝕的方法制備了探極的基極，其尖端曲率半徑小于200nm，錐角約為

7、10°左右。通過(guò)微納控制技術(shù)在基極外包裹介質(zhì)層(裸露尖端)，通過(guò)控制實(shí)驗(yàn)條件，可得到表面光滑，界限清晰的介質(zhì)層。利用直流濺射技術(shù)制備外極，制備膜厚約為100nm的Pt薄膜外極。通過(guò)以上步驟可穩(wěn)定制備微納熱電偶測(cè)溫探極，其測(cè)溫端尺寸為亞微米級(jí)。
　　使用一等標(biāo)準(zhǔn)水銀溫度計(jì)和高精度電壓表對(duì)微納熱電偶探極進(jìn)行溫度定標(biāo)，并通過(guò)通過(guò)曲線擬合，得到溫度與熱電動(dòng)勢(shì)的函數(shù)關(guān)系式和探極的Seebeck系數(shù)(4.6μV/℃至10.2μV/℃，分別為0

8、℃和90℃時(shí)的值)。
　　3.建立單細(xì)胞測(cè)溫系統(tǒng)
　　建立的單細(xì)胞測(cè)溫系統(tǒng)主要包括絕熱屏蔽箱、環(huán)境監(jiān)測(cè)裝置、熒光倒置顯微鏡、微納熱電偶探極的操控單元、微納熱電偶信號(hào)采集處理部分等。絕熱屏蔽箱可以使箱內(nèi)溫度不受環(huán)境干擾，通過(guò)環(huán)境監(jiān)測(cè)裝置可以監(jiān)測(cè)箱內(nèi)環(huán)境的變化范圍，使用微納探極的操控單元和熒光顯微鏡可以實(shí)時(shí)觀察和操控探極穿刺細(xì)胞，其操控分辨率達(dá)50nm，最大穿刺速度360mm/s。通過(guò)信號(hào)采集部分可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)溫度信號(hào)的變化

9、，溫度分辨率可達(dá)0.06℃。
　　4.研究了不同濃度、不同種類的抗癌藥物刺激下，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)溫度信號(hào)變化
　　使用了建立的單細(xì)胞測(cè)溫系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)溫度進(jìn)行了研究。首先使細(xì)胞培養(yǎng)液和需加藥物與環(huán)境溫度達(dá)到熱平衡后，將測(cè)溫探極穿刺入細(xì)胞，在不同濃度、不同種類的抗癌藥物(喜樹堿、阿霉素和紫杉醇)作用下，研究了單個(gè)U251細(xì)胞內(nèi)溫度信號(hào)變化。實(shí)驗(yàn)得出初步結(jié)論，使用的幾種濃度的喜樹堿都可使U251細(xì)胞內(nèi)溫度升高，并伴隨信號(hào)波動(dòng)，而阿霉素和