STIM1-TRPC1復(fù)合體對(duì)EPCs修復(fù)損傷血管能力的影響.pdf

1、1. 背景與目的
　　 血管內(nèi)皮損傷和損傷后的不良修復(fù)是冠心病、高血壓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)后再狹窄等血管損傷性疾病發(fā)病的共同病理生理基礎(chǔ)。如何盡早促進(jìn)血管損傷后的再內(nèi)皮化是防治這類疾病形成的關(guān)鍵策略。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，內(nèi)皮損傷的修復(fù)主要依靠臨近成熟內(nèi)皮的遷移和增殖，但其增殖能力有限。晚近的研究證實(shí)，骨髓和外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞(endotheliAlprog

2、enitor cells，EPCs)能歸巢至損傷血管局部，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管的良性修復(fù)。EPCs的增殖、遷移等生物學(xué)行為是其修復(fù)內(nèi)皮功能的基礎(chǔ)，然而，目前調(diào)控EPCs 生物學(xué)行為的機(jī)制，尤其是離子通道方面，仍不清楚。
　　 鈣離子是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能比如增殖、分化等的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子參與調(diào)控EPCs的增殖、歸巢及分化功能。鈣離子對(duì)細(xì)胞功能的影響通過胞膜鈣通道調(diào)控的鈣內(nèi)流來實(shí)現(xiàn)，在EPCs 這種非興奮性細(xì)胞，由于

3、缺乏電壓依賴性鈣通道，主要以鈣庫操縱性鈣通道為主(store-operated calcium channals，SOCs), SOCs 由基質(zhì)交聯(lián)分子1(stromAlinteracting molecule 1，STIM1)、Orai和瞬時(shí)受體電位通道(transientreceptor potentiAlcanonical，TRPC)家族構(gòu)成。STIM1在SOCs中發(fā)揮感受器作用，STIM1感受胞內(nèi)鈣庫耗竭，激活Orai和TRPC

4、通道，介導(dǎo)鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operatedcalcium entry，SOCE)，以補(bǔ)充胞內(nèi)鈣。
　　 晚近的研究發(fā)現(xiàn)，基因沉默STIM1可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖而抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的形成。TRPC1抗體也可抑制隱靜脈平滑肌細(xì)胞增殖導(dǎo)致的新生內(nèi)膜肥厚。而EPCs作為血管損傷修復(fù)中的一重要細(xì)胞來源，STIM1及TRPC1是否也通過影響EPCs的功能而參與血管損傷修復(fù)過程的調(diào)節(jié)，目前仍不清楚。我們的前期研究發(fā)

5、現(xiàn)，EPCs上有STIM1和TRPC1分子的表達(dá)。因此，我們提出假設(shè)，STIM1和TRPC1可能參與EPCs 增殖、遷移等生物理學(xué)形為的調(diào)節(jié)，從而影響其修復(fù)損傷血管的能力。
　　 2.方法
　　 2.1STIM1對(duì)EPCs 修復(fù)損傷血管能力的影響2.1.1STIM1對(duì)EPCs 增殖、遷移的作用2.1.1.1大鼠骨髓源EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定用密度梯度離心法分離大鼠骨髓源的單個(gè)核細(xì)胞，用含20％FBS的DMEM-L 培養(yǎng)基

6、培養(yǎng)。在普通顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，熒光雙染實(shí)驗(yàn)鑒定對(duì)DiI-Ac-LDL-和UEA-1均染色陽性的細(xì)胞為正在分化的EPCs。用流式細(xì)胞術(shù)鑒定EPCs表面分子CD34、CD45、CD133、及VEGFR2的表達(dá)。
　　 2.1.1.2 STIM1對(duì)EPCs 增殖、遷移的作用分離培養(yǎng)5-7天的大鼠骨髓源EPCs 用于實(shí)驗(yàn)。將STIM1干擾腺病毒質(zhì)粒(Ad-si/rSTIM1)、人源STIM1表達(dá)質(zhì)粒(Ad-hSTIM1)及對(duì)

7、應(yīng)的非沉默作用的對(duì)照腺病毒(NSC)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用于實(shí)驗(yàn)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和3H-TdR 摻入法檢測(cè)EPCs的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，較正的boyden小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。
　　 2.1.2 觀察STIM1對(duì)EPCs 修復(fù)損傷血管能力的影響復(fù)制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，用2％戊巴比妥鈉麻醉后，以頸前正中線為切口，暴露左頸總動(dòng)脈分叉，分離頸外動(dòng)脈，分別在頸外動(dòng)脈近、遠(yuǎn)兩側(cè)套線，結(jié)扎其遠(yuǎn)側(cè)。
　　

8、 用動(dòng)脈夾暫時(shí)阻斷頸內(nèi)和頸總動(dòng)脈血流，在頸外動(dòng)脈結(jié)扎近側(cè)穿刺，繼之將2FForgarty 導(dǎo)管沿小口送入頸總動(dòng)脈大約1-2cm，以1.5 atm-2 atm 充盈球囊，阻斷血流約30秒，然后緩慢來回抽動(dòng)球囊，反復(fù)3次，退出導(dǎo)管,結(jié)扎頸外動(dòng)脈，常規(guī)縫合傷口。術(shù)后立即經(jīng)尾靜脈注入事先轉(zhuǎn)染Ad-si/rSTIM1、Ad-hSTIM1和NSC 并且經(jīng)Dil-LDL 標(biāo)記的EPCs(1×106)。術(shù)后用青霉素預(yù)防感染。伊文氏藍(lán)染色觀察損傷后7天

9、、14天血管再內(nèi)皮化。HE 染色觀察損傷后14天新生內(nèi)膜的增生情況。
　　 2.2 觀察STIM1與TRPC1相互作用調(diào)控EPCs的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流免疫熒光檢測(cè)TRPC1在EPCs的定位，免疫共沉淀檢測(cè)STIM1與TRPC1在EPCs的相互作用。RT-PCR和Western blot 檢測(cè)TRPC1的表達(dá)，ELISA 方法檢測(cè)STIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后上清中IP3蛋白的表達(dá)情況。激光共聚焦檢測(cè)EPCs內(nèi)鈣變化情況。
　　 2.

10、3 TRPC1對(duì)EPCs的增殖和遷移的影響及其機(jī)制探討分離培養(yǎng)5-7天的大鼠骨髓源EPCs 用于實(shí)驗(yàn)。將TRPC1的小RNA 干擾質(zhì)粒(siRNA-TRPC1)及對(duì)應(yīng)的非沉默作用的siRNA對(duì)照質(zhì)粒(siRNA-control)、TRPC1的發(fā)夾狀RNA 干擾質(zhì)粒(shRNA-TRPC1)及對(duì)應(yīng)的非沉默作用的shRNA對(duì)照質(zhì)粒(shRNA-control)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48～72小時(shí)后用于實(shí)驗(yàn)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和3H-TdR摻入法檢測(cè)EP

11、Cs的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，較正的boyden小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，激光共聚焦檢測(cè)EPCs內(nèi)鈣變化情況。用細(xì)胞周期基因芯片篩選TRPC1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPCs 48小時(shí)后細(xì)胞周期基因的變化情況，篩選TRPC1作用的下游靶點(diǎn)。
　　 選擇芯片中變化最大的基因激活和或阻斷其功能，觀察在沉默TRPC1的基礎(chǔ)上EPCs的增殖和細(xì)胞周期的變化，探討TRPC1的下游靶點(diǎn)。
　　 3．結(jié)論
　　 本研究主要結(jié)論：<