刺激隱核蟲感染大黃魚的miRNA和mRNA組學(xué)測序及關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、大黃魚（Larimichthys crocea Richardson，1846）曾是我國的傳統(tǒng)四大海洋漁業(yè)對象之一，也是我國目前最主要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一，2015年養(yǎng)殖年產(chǎn)量超過14萬噸。近年來由于發(fā)展模式的制約，養(yǎng)殖管理的缺失，加之養(yǎng)殖環(huán)境的嚴(yán)重污染，大黃魚養(yǎng)殖過程中的各種病毒性疾病，細(xì)菌疾病和寄生蟲疾病日趨嚴(yán)重，其中以刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）病的危害最為嚴(yán)重。其所感染大黃魚并導(dǎo)致繼發(fā)性的細(xì)菌感

2、染，造成養(yǎng)殖大黃魚大面積死亡，對該養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)損失極大。
　　本研究采用多組學(xué)研究方法，利用miRNA-seq和mRNA-seq高通量測序技術(shù)，分析了大黃魚肝臟組織和鰓組織在感染刺激隱核蟲前后，以及感染刺激隱核蟲不同敏感組間的差異表達(dá)miRNA和差異表達(dá)mRNA基因，篩選差異表達(dá)miRNA和差異基因進行KEGG信號通路富集，以分析大黃魚響應(yīng)刺激隱核蟲感染的關(guān)鍵信號通路。此外，根據(jù)兩個組學(xué)的測序結(jié)果，對miRNA-mRNA進行關(guān)聯(lián)分析，

3、繪制關(guān)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，篩選大黃魚響應(yīng)刺激隱核蟲感染的關(guān)鍵miRNA及其靶基因;還通過實時熒光定量PCR方法對差異表達(dá)miRNA和mRNA基因進行了定量分析驗證，結(jié)果表明miRNA-seq和mRNA-seq高通量測序結(jié)果準(zhǔn)確、可信。本研究的主要結(jié)果如下:
　　(1)大黃魚感染刺激隱核蟲miRNA測序分析。成功構(gòu)建了大黃魚感染刺激隱核蟲前后，肝臟組織與鰓組織對照組(L-c/G-c)、感染敏感組(L-s/G-s)及感染非敏感組(L-ins

4、/G-ins)的miRNA文庫。肝臟組織中，L-c、L-s、L-ins組鑒定到已知miRNA數(shù)量分別為496、465和504條;鑒定到novel-miRNA分別為562、580和526條;L-c與L-s組，差異表達(dá)miRNAs共83條; L-c與L-ins組差異表達(dá)miRNAs共78條;鰓組織中，G-c、G-s、G-ins組鑒定到已知miRNA分別為478、552和606條;鑒定到novel-miRNA分別為555、543和529條;G

5、-c與G-s組差異表達(dá)miRNAs共65條;G-c與G-ins組間差異表達(dá)miRNAs共76條。隨機選取10條miRNA進行real-time PCR驗證，結(jié)果與測序結(jié)果基本一致，驗證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。差異基因的KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，不同組間的差異基因富集結(jié)果略有不同，但基本都顯著富集于脂質(zhì)代謝以及一系列免疫相關(guān)通路中。
　　(2)大黃魚感染刺激隱核蟲mRNA測序分析。構(gòu)建大黃魚感染刺激隱核蟲前后，肝臟組織與鰓組織

6、對照組(L-c/G-c)、感染敏感組(L-s/G-s)及感染非敏感組(L-ins/G-ins)的mRNA文庫，分析了差異基因在刺激隱核蟲感染前后、以及感染不同敏感組間的表達(dá)模式;對各個文庫的剪切類型進行分析比較，顯示各個文庫中以intergenic基因間區(qū)剪切類型的比例最高，而鰓組織中可變剪切的數(shù)量要高于肝臟組織中。統(tǒng)計結(jié)果顯示，共注釋到20282條已知基因，預(yù)測到新基因的數(shù)量為1064條;L-c、L-s及L-ins樣品組分別注釋到已知

7、基因數(shù)為16668，16502和15686條，預(yù)測新基因數(shù)目為771，747和686條。而在鰓組織樣品組中，注釋和預(yù)測的基因數(shù)目較多，G-c、G-s及G-ins樣品組注釋到已知基因18898，18187和18218條，預(yù)測到新基因分別為978，945和954條。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，各組間差異基因多顯著富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、花

8、生四烯酸代謝通路(Arachidonic acid metabolism)中，且不同組間富集模式有所不同。
　　(3)對差異表達(dá)miRNA及mRNA進行關(guān)聯(lián)分析，繪制關(guān)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析miRNA參與的生物學(xué)過程。篩選到mir-466-x，mir-466-y，mir-4968-y，mir-8485-y和mir-1895-y等具有多靶基因的關(guān)鍵miRNA，表明miRNA可調(diào)控多個靶基因的表達(dá)，且單個靶基因也有可能受到多個miRNA的協(xié)

9、同調(diào)控作用。
　　綜上所述，采用miRNA-seq和mRNA-seq高通量測序技術(shù)，從miRNA和mRNA兩個組學(xué)的水平對于大黃魚肝臟及鰓組織響應(yīng)刺激隱核蟲感染進行了系統(tǒng)研究。篩選出差異表達(dá)miRNA與mRNA，并通過GO功能注釋、KEGG富集分析、miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析及real-time PCR對差異基因進行研究和驗證。研究結(jié)果為宏觀了解大黃魚響應(yīng)刺激隱核蟲感染的生理過程和后續(xù)免疫相關(guān)關(guān)鍵基因的研究提供了基礎(chǔ)資料