不同核基因背景下超級復(fù)合體組成形式的研究.pdf

1、研究背景:
　　線粒體呼吸鏈的多個復(fù)合體可以進一步組裝成更大的超級復(fù)合體，但是只有超級復(fù)合體Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn可以直接從NADH傳遞電子到氧。由于線粒體是為機體產(chǎn)生能量供應(yīng)極為重要的細(xì)胞器，因此線粒體呼吸鏈超級復(fù)合體在人類疾病中發(fā)揮了重要的作用，比如癌癥與衰老等。近年來，有報道稱在小鼠中超級復(fù)合體Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn的組成形式是否存在主要與小鼠核基因背景相關(guān)。然而，我們的研究發(fā)現(xiàn)超級復(fù)合體Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn的組成形式在不同人與小鼠的細(xì)胞系

2、中都存在。我們將靠近CⅤ二聚體最近的超級復(fù)合體定義為LSC，以往的文獻(xiàn)報道認(rèn)為LSC僅由Ⅰn+Ⅲn組成，我們通過非變性膠分析，發(fā)現(xiàn)在部分人與小鼠的細(xì)胞系中LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn組成。并且我們通過確認(rèn)LSC中cytc的存在輔助驗證了LSC具有完整的傳遞電子的功能，進而說明LSC可能是一個可以行使呼吸功能的實體。此外，我們發(fā)現(xiàn)一個由于LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)缺陷而引起功能缺陷的線粒體復(fù)合體Ⅰ編碼基因ND1上m.3697G＞A突變導(dǎo)致的L

3、eigh綜合征的病人的呼吸功能下降以及ATP生成減少。通過本課題的研究，我們驗證了LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)可能是有功能的實體，并且是因其缺陷會導(dǎo)致疾病發(fā)生的一個重要因素。
　　目的:
　　1、通過研究發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞系的超級復(fù)合體組成是有差異的，由于以往的報道中多數(shù)細(xì)胞系的LSC僅由Ⅰn+Ⅲn組成，我們選定多種小鼠以及人的細(xì)胞系進行驗證LSC的組成。
　　2、篩選線粒體復(fù)合體Ⅰ相關(guān)的核基因(NDUFS3)以及線粒體基因

4、(ND1、ND6)突變的線粒體代謝疾病的患者，分別構(gòu)建永生化細(xì)胞系和融合細(xì)胞系。研究不同核基因背景以及線粒體背景的細(xì)胞模型LSC的組成差異。
　　3、通過2D BN/SDS-PAGE驗證LSC中cyt c的存在以及用氯霉素(CAP)處理監(jiān)測其動態(tài)變化過程（組裝與去組裝），驗證LSC在線粒體呼吸鏈超級復(fù)合體中的重要功能。
　　4、通過對構(gòu)建的高低異質(zhì)率細(xì)胞模型(ND1: m.3697G＞A)檢測其線粒體功能差異性，揭示線粒體遺

5、傳學(xué)背景在Leigh氏綜合征中的發(fā)生發(fā)展機制及其臨床診斷應(yīng)用價值。
　　方法:
　　1、通過BN-PAGE技術(shù)檢測小鼠的3A19（C57BL/6J鼠源）細(xì)胞系的超級復(fù)合體的組成形式，并從C57BL/6J小鼠肝臟組織提取線粒體蛋白，進行CⅠ和CⅣ的IGA驗證了超級復(fù)合體的活性。
　　2、通過BN-PAGE技術(shù)檢測了小鼠的HIB1B、A9、3T3-L1和C2C12細(xì)胞系，人的Hela、MDA-MB-231以及143B細(xì)胞系

6、的超級復(fù)合體的組成形式。
　　3、查閱文獻(xiàn)，確定本課題所用細(xì)胞系的來源。
　　4、通過BN/SDS-PAGE技術(shù)在143B及HIB1B細(xì)胞系中驗證LSC的組成差異。
　　5、構(gòu)建三個正常人以及核基因(NDUFS3)突變家系的永生化細(xì)胞系;收集并抽取患者外周血，提取其淋巴細(xì)胞構(gòu)建永生化細(xì)胞系。通過BN-PAGE技術(shù)檢測構(gòu)建的永生化細(xì)胞系的超級復(fù)合體的組成形式。
　　6、通過BN/SDS-PAGE驗證LSC中cyt

7、c的存在，進一步確認(rèn)LSC是否存在完整的傳遞電子的功能。
　　7、通過BN-PAGE技術(shù)，研究加入CAP培養(yǎng)HIB1B與C2C12細(xì)胞系后，LSC的組裝與去組裝動力學(xué)。其中HIB1B細(xì)胞系的LSC由Ⅰn+Ⅲn組成，C2C12細(xì)胞系的LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn組成。
　　8、構(gòu)建線粒體基因(ND1) m.3697G＞A突變的線粒體代謝疾?。↙eigh Syndrome）的家系的融合細(xì)胞模型，收集并抽取患者外周血，提取血小板，用來

8、構(gòu)建融合細(xì)胞模型。通過酶切鑒定細(xì)胞克隆異質(zhì)率，挑選高低異質(zhì)率克隆各一個，分別為L、H細(xì)胞系，并用線粒體通用24對引物PCR擴增mtDNA全序，通過全序分析驗證兩個細(xì)胞克隆。
　　9、對3697位點進行保守性分析;對m.3697G＞A家系抽血提取DNA，PCR后進行測序分析。
　　10、通過BN-PAGE技術(shù)檢測L、H細(xì)胞系的復(fù)合體Ⅰ的膠內(nèi)酶活性，五個單一復(fù)合體總量的變化，以及CⅠ、CⅢ、CⅣ相關(guān)的超級復(fù)合體的組裝形式。以及S

9、DS-PAGE檢測五個復(fù)合體亞基的變化。并通過BN/SDS-PAGE技術(shù)再次確認(rèn)LSC在兩個細(xì)胞克隆中的組成差異。
　　11、通過BN-PAGE技術(shù)，研究加入CAP培養(yǎng)L、H細(xì)胞系后LSC的組裝與去組裝動力學(xué)。
　　12、構(gòu)建線粒體基因(ND6)m.14487T＞C突變的線粒體代謝疾?。↙eigh Syndrome）的家系的融合細(xì)胞模型，收集并抽取患者外周血，提取血小板，用來構(gòu)建融合細(xì)胞模型;挑選高低異質(zhì)率克隆各一個。通過B

10、N-PAGE技術(shù)檢測高低異質(zhì)率克隆的超級復(fù)合體的組成形式。與m.3697G＞A的超級復(fù)合體形式進行比較。
　　13、將L、H細(xì)胞系培養(yǎng)至最佳狀態(tài)后，檢測兩者的線粒體功能，分析兩者的線粒體功能差異性。
　　1)應(yīng)用Clark氧電極檢測L、H細(xì)胞系氧耗量。
　　2)應(yīng)用TMRM熒光染料檢測L、H細(xì)胞系膜電位水平。
　　3)應(yīng)用ATP檢測試劑盒檢測L、H細(xì)胞系產(chǎn)生ATP的水平。
　　4)應(yīng)用乳酸檢測試劑盒檢測L、

11、H細(xì)胞系的乳酸產(chǎn)生量。
　　5)應(yīng)用ROS檢測試劑盒檢測L、H細(xì)胞系ROS的產(chǎn)生水平。
　　14、統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用SPSS16.0軟件分析L、H細(xì)胞系之間復(fù)合體表達(dá)量和線粒體功能的差異。
　　結(jié)果:
　　1、通過BN-PAGE技術(shù)檢測了小鼠及人的多個細(xì)胞系的超級復(fù)合體的組成形式。LSC有兩種形式，3A19、HIB1B、A9以及Hela細(xì)胞系中LSC僅由Ⅰn+Ⅲn組成;3T3-L1、C2C12、MDA-MB-231

12、以及143B細(xì)胞系中LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn組成。
　　2、查閱文獻(xiàn)，確定本課題所用細(xì)胞系的來源。3A19細(xì)胞系源自C3H非整倍體小鼠;HIB1B細(xì)胞系源自C57BL小鼠;A9細(xì)胞系源自Swiss Webster小鼠;3T3-L1細(xì)胞系源自Swiss albino小鼠;C2C12細(xì)胞系源自C3H整倍體小鼠;Hela細(xì)胞系源自一位美國婦女海莉耶塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的子宮頸癌細(xì)胞;MDA-MB-231細(xì)胞系源自

13、高加索人乳腺癌細(xì)胞;143細(xì)胞系源自高加索入骨肉瘤細(xì)胞。
　　3、通過BN/SDS-PAGE技術(shù)在143B及HIB1B細(xì)胞系中驗證確認(rèn)了LSC的組成差異與BN-PAGE一致，即143B細(xì)胞系LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn組成;HIB1B細(xì)胞系LSC由Ⅰn+Ⅲn組成。
　　4、通過BN-PAGE技術(shù)檢測三個正常人構(gòu)建的永生細(xì)胞系的LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn組成;在NDUFS3突變家系的永生化細(xì)胞系中可以發(fā)現(xiàn)與正常對照比較，LSC的含量

14、下降了。
　　5、通過BN/SDS-PAGE技術(shù)檢測LSC（Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn）中是否存在cyt c，發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞系中僅可以檢測到CⅠ和CⅢ，然而143B細(xì)胞系中不但可以檢測到CⅠ和CⅢ，還可以檢測到CⅣ和cyt c。證明了LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)的確是有完整的呼吸功能的實體。
　　6、通過使用不影響mtDNA拷貝數(shù)，但是可逆抑制線粒體蛋白翻譯的藥物CAP處理細(xì)胞。首先研究組裝動力學(xué)，通過結(jié)果可得，移除CAP4h開始LS

15、C就開始進行組裝，通過灰度分析計算可得，在4-48h時間段里，檢測CⅠ相關(guān)的超級復(fù)合體，HIB1B細(xì)胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn)增加了32倍;C2C12細(xì)胞系的LSC（Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn）增加了25倍。CⅢ相關(guān)的超級復(fù)合體得到一致的趨勢，可得C2C12細(xì)胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)組裝相對較慢。
　　7、通過研究去組裝動力學(xué)，分析結(jié)果可得，在0-24h的時間段里，檢測CⅠ相關(guān)的超級復(fù)合體，HIB1B細(xì)胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn)下降

16、了71.18％; C2C12細(xì)胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)下降了36.07％。CⅢ相關(guān)的超級復(fù)合體得到一致的趨勢，可得C2C12細(xì)胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)去組裝相對較慢。
　　8、通過在多個物種中對3697位點進行保守性分析，發(fā)現(xiàn)該位點十分保守，一旦該位點發(fā)生突變，可能會對人體產(chǎn)生極大危害。
　　9、通過對m.3697G＞A家系，對照（母親）及患者（兒子）進行測序分析，一代測序結(jié)果顯示對照無突變或突變極低，二代測

17、序顯示該患者為100％突變。
　　10、通過PCR-RFLP對m.3697G＞A家系挑出的細(xì)胞克隆進行鑒定，最后篩選到異質(zhì)率為0％的細(xì)胞克隆L以及100％的細(xì)胞克隆H來進行后面的研究。
　　11、通過對L、H細(xì)胞系的mtDNA測全序，發(fā)現(xiàn)除3697位點G＞A突變外，無其他突變。
　　12、通過膠內(nèi)酶活性結(jié)果可得H細(xì)胞系的活性相對于L細(xì)胞系下降了約30％; CⅠ的含量下降了約35％，CⅡ、CⅢ、CⅣ、CⅤ的含量沒有差異。

18、所以m.3697G＞A突變僅僅導(dǎo)致了CⅠ的缺陷。
　　13、通過SDS-PAGE分析可得L、H兩個細(xì)胞系的五個復(fù)合體亞基水平?jīng)]有差異。所以，并不是由于復(fù)合體亞基水平下降而導(dǎo)致CⅠ的表達(dá)下降。
　　14、通過BN-PAGE分析可得兩個細(xì)胞克隆超級復(fù)合體亞基除了LSC有差異，P＜0.05，其他超級復(fù)合體沒有差異。所以，m.3697G＞A的致病可能是由于LSC的組成差異引起的。
　　15、通過BN/SDS-PAGE研究進一步

19、確認(rèn)了L、H兩個細(xì)胞系LSC的差異，L細(xì)胞系的LSC中的CⅣ含量明顯高于H。
　　16、通過對L、H細(xì)胞系加藥CAP研究其組裝動力學(xué)，可得L細(xì)胞系LSC的組裝明顯快于H細(xì)胞系。進一步說明LSC的差異極有可能是引起疾病發(fā)生的原因。
　　17、通過研究發(fā)現(xiàn)m.14487T＞C家系挑選的高低異質(zhì)率細(xì)胞克隆中并沒有發(fā)現(xiàn)與m.3697G＞A突變類似的LSC變化。說明LSC的差異在m.3697G＞A中是特異存在的。
　　18、通過

20、檢測L、H細(xì)胞系的線粒體相關(guān)的功能，L細(xì)胞系相比于H細(xì)胞系來說，其線粒體的氧耗量較高，膜電位水平較高，線粒體CⅠ產(chǎn)生的相關(guān)的ATP水平較高，乳酸及ROS的產(chǎn)生量較低。說明L細(xì)胞系的線粒體OXPHOS功能更強。
　　結(jié)論:
　　1、源于不同人與小鼠的多種細(xì)胞系的超級復(fù)合體的組成形式不同，由上述的1-5實驗結(jié)果得出，核基因背景不同影響了超級復(fù)合體的組成形式;并且我們發(fā)現(xiàn) LSC的組成形式分為Ⅰn+Ⅲn與Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn。通過LS

21、C中cyt c的檢測確認(rèn)其有完整的呼吸功能。
　　2、選用HIB1B細(xì)胞系(Ⅰn+Ⅲn)與C2C12細(xì)胞系(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)進行LSC的組裝與去組裝動力學(xué)研究。由上述的6-7實驗結(jié)果得出，C2C12細(xì)胞系的組裝與去組裝較HIB1B細(xì)胞系慢。得出結(jié)論，包含CⅣ的超級復(fù)合體比沒有CⅣ的超級復(fù)合體更加穩(wěn)定。
　　3、通過非變性膠技術(shù)對L、H高低異質(zhì)率細(xì)胞系的OXPHOS完整性進行研究，由上述的8-17實驗結(jié)果得出，可得MT-ND