基于液質聯(lián)用技術的連翹體內外代謝研究.pdf

1、中國藥典(2010年版一部)收載的連翹為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物連翹(Forsythia suspense(Thunb.)Vahl)的干燥果實。該屬植物多叢生于山野荒坡間，各地亦有人工栽培。廣泛分布在遼寧、河北、等地。人們對其化學成分進行分析，發(fā)現(xiàn)該植物富含木脂素類、黃酮類、苯乙醇類及揮發(fā)油類等成分。連翹為中醫(yī)常用的清熱解毒藥，近年來，國內外對連翹藥理學作用的報道也逐漸增多，主要集中在以下幾方面：抗菌作

2、用、抗病毒、抗炎作用、抗內毒素作用、抑制彈性蛋白酶、cAMP磷酸二酯酶活力的作用、保肝、利尿作用、解熱作用及鎮(zhèn)吐、鎮(zhèn)痛作用等。迄今，國內外學者對該植物的化學成分分離與鑒定、體外定量分析研究較為廣泛，而對于體內外代謝研究涉及頗少。然而連翹在中藥處方中占有很大的比重，研究連翹的體內外代謝途徑，探索連翹的藥效物質基礎就顯得格外重要。
　　液相色譜-質譜聯(lián)用技術(LC-MS)具有專屬性高、快速靈敏等優(yōu)點，是目前化學成分定性和定量分析的有力

3、工具。本研究采用LC-MS技術建立連翹中5種有效成分在大鼠膽汁中的定量分析方法，為闡明其體內代謝途徑奠定基礎；LC和LC-MS法研究大鼠腸內菌體外轉化連翹苷的代謝產物，并用制備液相制備出3種代謝產物，核磁共振技術確定代謝物結構；建立血漿樣品中連翹苷及其2種代謝產物的LC-MS定量分析方法，探索其藥代動力學參數；建立灌胃給予大鼠連翹苷水溶液后，不同時間點的大鼠膽汁、糞便和尿液中連翹苷及其3種代謝物的定量分析方法，研究其體內排泄規(guī)律，進一步

4、了解連翹苷的體內代謝過程及藥效物質基礎。
　　第一部分 LC-ESI-MS-MS法同時測定大鼠膽汁中連翹5種有效成分的含量
　　目的：建立一種專屬性好、靈敏快捷的方法同時測定大鼠膽汁中連翹5種有效成分的含量，考察其在大鼠體內的膽汁排泄動力學規(guī)律。
　　方法：大鼠按20 mg/kg灌胃給予連翹水提液后于不同時間點采集膽汁樣品，用LC-ESI-MS技術MRM負離子掃描模式定量分析膽汁中連翹5種有效成分的經時變化。質譜條件：

5、離子源為電噴霧離子化源(ESI)；采用多反應離子監(jiān)測(MRM)進行負離子檢測；源噴射電壓(IS)為-4500 V；霧化溫度為600℃；霧化氣(GS1，N2)：40 psi；輔助氣(GS2，N2)：50 psi；氣簾氣(N2)：25 psi。5種被測成分的監(jiān)測離子對分別為(+)-pinoresinol-β-D-glucoside(519.3/357.2)，matairesinol-4’-O-glucoside(519.3/357.2)，h

6、yperin(463.2/300.1)，phillyrin(533.5/371.2)，phillygenin(371.2/356.1)。色譜條件：色譜柱：Sapphire C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm，美國)，Sapphire C18保護柱；流動相：含0.1％甲酸的甲醇-水，梯度洗脫；流速：0.7 mL/min；分析時間：15 min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。
　　結果：所建立的方法精密度、準確度、檢測

7、限和定量限均符合要求，被測5種有效成分在測定范圍內線性關系良好。膽汁排泄藥動學試驗表明，連翹5種有效成分在36 h內經膽汁排泄完全，5種有效成分的排泄量都主要集中在10～12 h。5種有效成分的膽汁累積排泄量分別約占給藥量的0.002％，0.234％，0.116％，0.288％和12.700％。
　　結論：本研究建立了LC-ESI-MS-MS法同時測定大鼠膽汁中連翹5種有效成分的含量，可用于連翹中5種有效成分在大鼠體內的排泄動力學

8、研究，該方法簡便、快速。專屬性好，可用于連翹5種有效成分在大鼠膽汁中的定量分析，該法對連翹藥材的體內定量分析具有重要意義。
　　第二部分大鼠腸內菌轉化連翹苷的代謝產物研究
　　目的：將連翹苷與大鼠腸內菌于體外厭氧溫孵培養(yǎng)，建立LC-MS/MS方法研究腸內菌轉化連翹苷的代謝產物。并放大制備轉化產率最高的代謝物。
　　方法：將大鼠新鮮糞便和連翹苷于體外厭氧溫孵培養(yǎng)，對連翹苷進行體外代謝研究，尋找代謝產物并進行放大制備，得到

9、代謝產物單體，通過1H-NMR和MS方法鑒定其代謝產物，確定結構。
　　結果：發(fā)現(xiàn)3種代謝產物，用制備液相放大制備，純化得到3種代謝產物的單體，通過1H-NMR和MS法對其進行結構確證，經鑒定，代謝產物分別2-[(3'，4'-二羥基)苯基]-6-[(3''，4''-二羥基)苯基]駢雙四氫呋喃(M1)、2-[(3'，4'-二羥基)苯基]-6-[(3''，4''-二甲氧基)苯基]駢雙四氫呋喃(M2)、2-[(3'，4'-二羥基)苯基]

10、-3-羥甲基-4-[(3''，4''-二甲氧基)苯甲基]四氫呋喃(M3)。
　　結論：腸內菌法可用來研究連翹苷的體外代謝，為進一步研究連翹的代謝途徑奠定基礎。
　　第三部分 HPLC-MS法同時測定大鼠血漿中連翹苷及其2種代謝物的含量
　　目的：建立一種可用于測定大鼠血漿中連翹苷、2-[(3’，4’-二羥基)苯基]-6-[(3''，4''-二羥基)苯基]駢雙四氫呋喃(M1)和2-[(3'，4'-二羥基)苯基]-6-[(

11、3''，4''-二甲氧基)苯基]駢雙四氫呋喃(M2)含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給予連翹苷水溶液后的藥代動力學研究。
　　方法：收集灌胃給予大鼠連翹苷水溶液后的血漿樣品，用丙酮沉淀蛋白后進行樣品分析，以甲醇-水(各含0.1％的甲酸)作為流動相梯度洗脫，磺胺甲噁唑(SMZ)作為內標，正負離子模式下同時監(jiān)測。連翹苷(552.10/249.20)在正離子模式下檢測，內標SMZ(254.10/156.00)；M1(328.90

12、/136.90)、M2(357.00/151.00)在負離子模式下檢測，內標SMZ(252.00/155.90)。
　　結果：該方法精密度、準確度、檢測限和定量限均符合要求，血漿中連翹昔、M1和M2在測定濃度范圍內均具有良好的線性范圍。M1和M2藥代動力學參數具有一致性，連翹苷原藥消除較快，達峰早于M1和M2。
　　結論：該方法專屬性好、簡便快速，靈敏度高，可用于大鼠灌胃連翹苷后，血漿中連翹苷和其2種代謝物的藥代動力學研究，

13、該結果可為連翹的臨床用藥提供參考依據。
　　第四部分連翹苷及其3種代謝物在大鼠體內的排泄動力學
　　目的：建立一個快速簡便的方法定量灌胃給藥后大鼠膽汁、糞便和尿液中連翹苷及其三種代謝物，考察連翹苷及其3種代謝物M1、M2和M3在大鼠膽汁、糞便和尿液中排泄動力學，進一步完善連翹苷的體內代謝。
　　方法：大鼠按20 mg/kg灌胃給予連翹苷水溶液后于不同時間采集膽汁、糞便、尿液樣品，用LC-ESI-MS技術MRM正負離子同

14、時監(jiān)測的方法分析膽汁、糞便和尿液中連翹苷及其3種代謝物的經時變化。以甲醇-水(各含0.1％的甲酸)作為流動相梯度洗脫，磺胺甲噁唑(SMZ)作為內標，連翹苷(552.10/249.20)在正離子模式下檢測，內標SMZ(254.10/156.00)；M1(328.90/136.90)、M2(357.00/151.00)、M3(359.00/146.80)在負離子模式下檢測，內標SMZ(252.00/155.90)。
　　結果：膽汁、糞