核盤菌侵染油菜早期光譜診斷方法研究.pdf

1、油菜菌核病是一種位居油菜三大病害之首的真菌性病害，嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，從苗期至收獲期均可發(fā)生。感染核盤菌的花瓣被認(rèn)為是主要傳染源，染菌花瓣可迅速引起油菜莖、葉組織的發(fā)病;壞死的莖稈又可造成整株的倒伏，造成的損失最為嚴(yán)重;同時(shí)，染病的葉片組織還會(huì)影響植株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)的傳送，對(duì)油菜籽粒質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。因此，進(jìn)行核盤菌侵染油菜植株的快速檢測(cè)具有重要意義。本研究以油菜作物為研究對(duì)象，應(yīng)用可見(jiàn)-近紅外高光譜成像技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)油菜葉片核盤菌侵染

2、組織處的光譜特性和葉綠素含量的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)核盤菌侵染油菜葉片的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè);采用激光共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)不同病斑直徑周圍組織的拉曼光譜從微觀角度進(jìn)行核盤菌早期侵染的動(dòng)態(tài)診斷;采用近紅外高光譜技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行核盤菌侵染油菜花瓣快速診斷檢測(cè);并通過(guò)花瓣樣本化合物的拉曼成像分布變化實(shí)現(xiàn)核盤菌侵染過(guò)程中油菜花瓣成分的可視化檢測(cè);采用激光共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)油菜莖稈橫截面健康組織與核盤菌侵染組織處化合物的化學(xué)成像從微觀角度

3、進(jìn)行核盤菌侵染莖稈的早期診斷。從宏觀角度（葉片、花瓣表面）以及微觀角度（細(xì)胞）出發(fā)，運(yùn)用多種光譜實(shí)現(xiàn)了核盤菌侵染油菜葉片、花瓣和莖稈組織的早期診斷，同時(shí)也為深入研究寄主-病原物在細(xì)胞層面上的互作機(jī)制提供新的研究途徑，也為農(nóng)業(yè)田間作物的科學(xué)施藥和精準(zhǔn)化管理提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。主要研究結(jié)論如下:
　　(1)采用高光譜成像技術(shù)進(jìn)行核盤菌侵染油菜葉片動(dòng)態(tài)發(fā)展的快速檢測(cè)。以健康的和染菌不同階段油菜葉片的高光譜響應(yīng)規(guī)律出發(fā)，通過(guò)各四類樣本

4、間的反射率差值結(jié)合單因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA）發(fā)現(xiàn)健康樣本與染病不同階段樣本在687 nm處存在顯著性差異(p＜0.05);運(yùn)用主成分分析(Principal component analysis，PCA)發(fā)現(xiàn)健康樣本與染病不同階段的樣本在主成分-1(principal component，PC-1)和主成分-4(PC-4)組成的二維空間可以形成較好的聚類;采用反射率差值、x載荷系數(shù)(x-loa

5、dings)和隨機(jī)青蛙算法（Random frog，RF）選擇的特征波段建立偏最小二乘判別分析(Partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由RF選出的630，640，650，757和789nm特征波段所建立的PLS-DA模型判別準(zhǔn)確率為713％;由RF選出的6條特征波段(565，626，637，640，650和790nm)與油菜葉片葉綠素含量建立的偏最小二乘回歸(P

6、artial leastsquare regression，PLSR)模型的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.663，并基于PLSR模型得到線性公式:y=4.028-2.411x1-2.123x2-2.771x3-0.140x4-2.586x5-2.037x6，(y是預(yù)測(cè)的葉綠素含量;x1是波長(zhǎng)在i nm處對(duì)應(yīng)的光譜反射值），借助以上公式和開(kāi)發(fā)的圖像分析算法得到油菜葉片葉綠素含量的化學(xué)成像，從而實(shí)現(xiàn)核盤菌侵染油菜葉片動(dòng)態(tài)發(fā)展的快速檢測(cè)。
　　(2)采

7、用顯微拉曼光譜技術(shù)從微觀角度進(jìn)行核盤菌侵染油菜葉片的早期動(dòng)態(tài)診斷。獲取核盤菌侵染的三個(gè)階段區(qū)域處（健康，染病區(qū)1和染病區(qū)2）的拉曼光譜，采用小波變換(Warelet transform，WT)與基線校正(Baseline)進(jìn)行拉曼光譜的預(yù)處理;并運(yùn)用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):三類樣本位于特征峰1006，1156和1522 cm-1處的拉曼強(qiáng)度值在p＜0,05水平處存在顯著性差異;三類樣本在PC-1和PC-2組成的二維空間以及10

8、06，1156和1522 cm-1構(gòu)成的三維空間具有較好的聚類效果;基于PC-1，PC-2和特征峰1006，1156和1522 cm-1數(shù)據(jù)建立的LS-SVM判別模型的識(shí)別率分別為100％，66.7％，700％，100％和100％;研究結(jié)果表明采用1156 cm-1和1522 cm-1建立的判別模型可以實(shí)現(xiàn)核盤菌侵染油菜葉片的早期動(dòng)態(tài)診斷。
　　(3)應(yīng)用近紅外高光譜進(jìn)行核盤菌侵染油菜花瓣的快速檢測(cè)。應(yīng)用PCA進(jìn)行健康花瓣與染菌花

9、瓣的聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康花瓣與染菌花瓣在PC-3坐標(biāo)軸上具有明確分類;ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，健康花瓣與染菌花瓣在根據(jù)主成分-3的x載荷系數(shù)選出的1446nm波段(p＜0.05)處具有顯著性差異;采用根據(jù)x-載荷系數(shù)和RF提取特征波段建立LS-SVM判別模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)根據(jù)x-載荷系數(shù)和RF挑選的6條特征波段(1190，1460，1463，1524，1446，1656nm)所建立的LS-SVM模型的識(shí)別精度達(dá)92.7％。
　　(4)采

10、用激光顯微拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行核盤菌侵染油菜花瓣的快速檢測(cè)，并通過(guò)健康花瓣與染病花瓣組織處化合物的化學(xué)成像來(lái)實(shí)現(xiàn)核盤菌侵染過(guò)程中油菜花瓣成分變化的原位在體檢測(cè)?；谥鞒煞址治鲞M(jìn)行數(shù)據(jù)的壓縮和聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩類樣本在PC-1和PC-2組成的空間域有較好的聚類效果，根據(jù)x-載荷系數(shù)和回歸系數(shù)法（regressioncoefficients）進(jìn)行特征峰的選取并建立LS-SVM判別模型，結(jié)果表明基于指紋峰識(shí)別的5個(gè)特征峰(1006，1156，1

11、188，1213和1522 cm-1)建立的模型識(shí)別率為95.08％，而采用x載荷系數(shù)選擇的7個(gè)特征峰（1006，1077，1156，1188，1271，1392和1526 cm-1）建模達(dá)到100％的識(shí)別率。采用由指紋峰識(shí)別的5個(gè)特征峰進(jìn)行單波段化學(xué)成像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康花瓣上物質(zhì)分布均勻，而染菌花瓣由于菌絲的侵染造成內(nèi)部細(xì)胞的破損而出現(xiàn)化合物的分布不均。研究結(jié)果表明，從微觀角度可以進(jìn)行健康花瓣與染病花瓣組織處化合物的化學(xué)成像，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)核

12、盤菌侵染過(guò)程中油菜花瓣成分的可視化檢測(cè)。
　　(5)結(jié)合表面增強(qiáng)與激光共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)進(jìn)行核盤菌侵染油菜莖稈橫截面細(xì)胞的微觀檢測(cè)。以銀納米溶膠為表面增強(qiáng)劑，采用中值濾波和自適應(yīng)迭代重加權(quán)懲罰最小二乘法（Adaptive iterative re-weighted penalized least squares，air-PLS）進(jìn)行拉曼光譜的噪聲以及熒光背景預(yù)處理;獲取核盤菌侵染莖稈橫截面組織處不同位置的拉曼光譜，采用PC