傳代和低氧培養(yǎng)對(duì)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞表型及細(xì)胞骨架的影響.pdf

1、目的：
　　探討傳代和低氧培養(yǎng)對(duì)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞表型和細(xì)胞骨架的影響，為關(guān)節(jié)盤組織工程自組裝技術(shù)種子細(xì)胞的選擇提供依據(jù)，為關(guān)節(jié)盤細(xì)胞培養(yǎng)選擇適宜的氧環(huán)境。
　　方法：
　　體外分離、培養(yǎng)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞，傳代至第三代（P3），收集原代（P0）至第三代細(xì)胞（P3）。P3代細(xì)胞分別于不同低氧水平（2％O2，4%O2，8%O2）下培養(yǎng)，每次均以常氧（21%O2）培養(yǎng)作為對(duì)照。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、糖胺多糖和膠原蛋白染色觀察

2、，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。通過細(xì)胞骨架蛋白免疫熒光染色和RT-qPCR檢測(cè)關(guān)節(jié)盤細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）和波形蛋白（Vimentin）表達(dá)情況；MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同氧濃度下關(guān)節(jié)盤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況。
　　結(jié)果：
　　1、傳代培養(yǎng)過程中，關(guān)節(jié)盤細(xì)胞表型發(fā)生改變，表現(xiàn)為圓形細(xì)胞減少，長(zhǎng)梭形細(xì)胞增多，糖胺多糖表達(dá)減少；

3、I、II型膠原蛋白表達(dá)在P2代明顯增強(qiáng)，P3代明顯減弱；Aggrecan mRNA表達(dá)在P2和P3代明顯減弱（P<0.01），COL I和COL II mRNA表達(dá)在P2代明顯增強(qiáng)，P3代減弱（P<0.01），COL I/COL II的比值在P1代最高（P<0.01）。關(guān)節(jié)盤細(xì)胞骨架的變化表現(xiàn)為Actin表達(dá)增加，Tubulin和Vimentin表達(dá)在P2代最高，基因表達(dá)分析結(jié)果與熒光強(qiáng)度分析顯示一致。
　　2、MTT結(jié)果顯示，與

4、21%O2組比較，4%O2和8%O2條件下，細(xì)胞增殖明顯，在2%O2條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢(P<0.05)。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，與21%O2組比較，2%O2、4%O2和8%O2條件下，G0/G1期細(xì)胞減少，S期或G2/M期細(xì)胞增多(P<0.05)，細(xì)胞表現(xiàn)出較好的活力。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，各低氧組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率與對(duì)照組（21%O2）相比無明顯差異（P>0.05）。
　　3、低氧培養(yǎng)時(shí)，4%O2和8%O2條件下，細(xì)胞突起伸

5、長(zhǎng)，以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主，I、II型膠原蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)；2%O2條件下，少量細(xì)胞變圓，I型膠原弱表達(dá)。糖胺多糖表達(dá)在各氧氣濃度下未見明顯變化。2%O2條件下，COL I和Actin mRNA表達(dá)下調(diào)，Tubulin表達(dá)顯著增強(qiáng)；4%O2條件下，三種細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。8%O2條件下，關(guān)節(jié)盤細(xì)胞表型相關(guān)基因顯著下調(diào)（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、綜合考慮細(xì)胞表型和細(xì)胞骨架的改變可以更好的指導(dǎo)組織工程