金納米顆粒標(biāo)記呼吸道合胞病毒入侵細(xì)胞的實(shí)時(shí)暗場(chǎng)光散射成像分析.pdf

1、病毒，尤其是傳染性病毒，對(duì)人類(lèi)身體健康具有很大危害。因此，了解和闡明病毒入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程和機(jī)制對(duì)預(yù)防和治療病毒性疾病十分重要。目前，研究病毒入侵細(xì)胞過(guò)程常采用單個(gè)病毒視蹤技術(shù)，即通過(guò)觀察單個(gè)病毒入侵宿主細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)過(guò)程來(lái)闡釋病毒入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制。近年來(lái)，為成功示蹤病毒，人們常利用熒光蛋白分子或熒光染料對(duì)病毒和細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，但存在著熒光強(qiáng)度低、易光漂白等缺點(diǎn)，難于長(zhǎng)時(shí)間示蹤單個(gè)病毒。熒光量子點(diǎn)可以避免上述缺點(diǎn)，但其生物相容性和穩(wěn)

2、定性有待提高。因此如何避免標(biāo)記材料自身的不足是一個(gè)值得研究的問(wèn)題。本文利用生物相容性好的金納米顆粒標(biāo)記呼吸道合胞病毒(RSV)，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)病毒侵染宿主細(xì)胞過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)成像，有利于進(jìn)一步了解呼吸道合胞病毒侵染機(jī)制。具體的研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)方面:
　　1.選擇性定量細(xì)胞膜表面吸附的呼吸道合胞病毒。利用RSV多克隆抗體修飾的金納米顆粒靶向標(biāo)記病毒，并以宿主細(xì)胞作為檢測(cè)病毒的基底，通過(guò)統(tǒng)計(jì)靶向于細(xì)胞膜表面病毒所在位置的金納米顆粒的散

3、射信號(hào)的百分比，實(shí)現(xiàn)可視化定量細(xì)胞膜表面的病毒。當(dāng)將一定量的病毒加入細(xì)胞基底并洗棄未侵染細(xì)胞的多余病毒后，再加入RSV多克隆抗體修飾的金納米顆粒反應(yīng)一段時(shí)間，讓金納米顆粒靶向結(jié)合到細(xì)胞表面的病毒，在暗場(chǎng)下成像觀察發(fā)現(xiàn)，隨著所加病毒量增加，細(xì)胞表面金納米顆粒的散射信號(hào)逐漸增強(qiáng)。將所得成像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)病毒的量和細(xì)胞膜表面金納米顆粒散射信號(hào)的百分比呈函數(shù)增長(zhǎng)。此實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞作為病毒檢測(cè)基底，金納米顆粒散射信號(hào)作為檢測(cè)病毒量的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了可視

4、化定量具有感染能力的病毒。由此，對(duì)具有侵染能力的病毒建立了一種選擇性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單的可視化分析方法。
　　2.金納米顆粒標(biāo)記病毒侵染細(xì)胞的過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)控。利用鏈霉親和素(SA)修飾的金納米顆粒對(duì)病毒進(jìn)行標(biāo)記，在暗場(chǎng)下通過(guò)觀察金納米顆粒修飾的病毒的散射信號(hào)，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)觀察病毒侵染細(xì)胞的過(guò)程。SA是一種含有巰基的蛋白，可以通過(guò)金硫鍵修飾到金納米顆粒表面。另外通過(guò)對(duì)病毒表面的膜蛋白進(jìn)行生物素(Biotin)標(biāo)記制得生物素標(biāo)記病

5、毒。由于一分子SA可以和四分子生物素高度特異性結(jié)合，故SA修飾的金納米顆粒能用于標(biāo)記生物素化的病毒。金納米顆粒具有獨(dú)特的局域表面等離子體共振(LSPR)性質(zhì)，因此通過(guò)在暗場(chǎng)顯微鏡下觀察金納米顆粒修飾病毒的散射信號(hào)就可長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)觀察病毒入侵細(xì)胞的過(guò)程。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，病毒入侵細(xì)胞的過(guò)程快速、短暫，大約1分鐘左右的時(shí)間，且病毒入侵細(xì)胞可能是一個(gè)胞吞的過(guò)程。與其他熒光信號(hào)標(biāo)記病毒方法相比，金納米顆粒生物相容性好，穩(wěn)定性好，不存在信號(hào)強(qiáng)度低和易光

6、漂白的問(wèn)題，并且這種標(biāo)記策略簡(jiǎn)單、溫和、對(duì)病毒感染力影響較小。
　　3.熒光和散射雙模式成像呼吸道合胞病毒的核酸。本實(shí)驗(yàn)將金納米顆粒作為能量供受體和發(fā)光元件，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA作為病毒核酸RNA分子檢測(cè)元件，實(shí)現(xiàn)了病毒侵入細(xì)胞后，病毒核酸RNA復(fù)制過(guò)程的熒光和暗場(chǎng)雙模式成像。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA通過(guò)5'端的巰基偶聯(lián)至金納米顆粒表面，導(dǎo)致其3'端四甲基羅丹明（TAMRA）的熒光淬滅，金納米顆粒的散射信號(hào)減弱呈暗綠色。在堿基互補(bǔ)配對(duì)作用下，

7、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖部閉合。當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的環(huán)部與病毒核酸RNA雜交，金納米顆粒上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，TAMRA熒光恢復(fù)，金納米顆粒散射信號(hào)增強(qiáng)呈亮綠色。從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)病毒核酸RNA熒光和暗場(chǎng)雙模式成像。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，病毒侵入細(xì)胞后，在細(xì)胞膜附近區(qū)域進(jìn)行大量核酸復(fù)制。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA修飾的金納米顆粒探針制備簡(jiǎn)單，且將熒光成像和暗場(chǎng)成像成功的結(jié)合，可能被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域。
　　綜上所述，本文利用金納米顆粒實(shí)現(xiàn)了對(duì)RSV簡(jiǎn)單快速

8、標(biāo)記，利用金納米顆粒的散射信號(hào)，借助于暗場(chǎng)光散射成像技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間示蹤病毒侵染細(xì)胞過(guò)程。本文在保證病毒自身感染力的情況下實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒的簡(jiǎn)單快速標(biāo)記。選用金納米顆粒作為標(biāo)記材料避免了熒光染料和熒光蛋白的熒光信號(hào)弱、易光漂白及量子點(diǎn)生物相容性低、穩(wěn)定性不好等缺點(diǎn)。本文也實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞膜表面病毒的定量檢測(cè)、病毒入侵細(xì)胞過(guò)程及病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制RNA核酸過(guò)程的成像。論文對(duì)病毒侵染細(xì)胞過(guò)程由外到內(nèi)一一進(jìn)行成像分析，這對(duì)深入了解病毒侵染細(xì)胞機(jī)制提