海水浮游病毒提取技術(shù)及其熒光顯微計(jì)數(shù)方法.pdf

1、海洋中病毒含量極其豐富，多種多樣，是海洋中最普通的生物群體，是海洋生物化學(xué)循環(huán)中最大的一環(huán)，在微生物食物環(huán)中有著重要的生態(tài)學(xué)意義，可以影響許多生物地球化學(xué)過程和生態(tài)學(xué)過程，海洋病毒能夠侵染多種海洋生物，是海洋中最主要的致命體，幾乎對(duì)所有的海洋生物都有所影響，眾所周知，由病毒引起的病毒性傳染疾病，給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害和損失，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中急待解決的一大難題。 盡管如此，直到近幾年，人們對(duì)海洋病毒的認(rèn)識(shí)仍然大大落后于其實(shí)

2、際存在。近十年來，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，Berghetal.(1989)、Suttleetal.(1990)、Fuhrman(1999)、Kirchman(1999)和Mannetal.(2003)等陸續(xù)在Nature上發(fā)表了多篇有關(guān)海洋病毒生態(tài)作用的報(bào)告，人們才逐漸意識(shí)到海洋病毒的生態(tài)意義。 因此，開展對(duì)海洋游離病毒的基礎(chǔ)性研究，對(duì)不同海域的病毒進(jìn)行分離，建立我國不同海域的病毒分離物資源保存庫和病毒基因庫，將對(duì)海洋病毒生態(tài)學(xué)及流

3、行病學(xué)研究提供前提，對(duì)海洋生態(tài)動(dòng)力學(xué)的學(xué)科創(chuàng)新、海水養(yǎng)殖業(yè)病毒害防治和海水病毒的快速檢測(cè)鑒定具有重要意義。 本論文在農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助下，對(duì)海水中浮游病毒的存在及分布進(jìn)行了研究，初步建立了高效、快速、高通量提取純化海洋病毒的方法，對(duì)青島及附近海區(qū)的海水中浮游病毒做了熒光顯微計(jì)數(shù)定量，對(duì)濃縮分離后的病毒做了基因文庫構(gòu)建的初步研究。 為了從海水中提取純化病毒，本文對(duì)吸附洗脫法、化學(xué)絮凝法

4、等濃縮方法進(jìn)行了探索和嘗試，最后利用三氯化鋁沉淀病毒，同時(shí)加入滑石粉-硅藻土作為病毒吸附劑促進(jìn)病毒吸附沉淀的方法，初步建立起了一種可以通過處理大體積海水濃縮病毒的海水病毒提取方法，在青島近海海域的海水中成功提取到了游離的病毒。電鏡觀察的結(jié)果表明，海水中不僅存在著一定豐度的游離病毒，而且病毒的種類多種多樣。病毒形態(tài)有具纖突的球狀病毒、不具纖突的球狀病毒和桿狀病毒、噬菌體等，病毒粒子大小在40nm～400nm之間。 酚抽提法提取濃縮

5、純化后的病毒的核酸，分別機(jī)械剪切和酶切，利用大腸桿菌DH-5α菌株嘗試構(gòu)建病毒的基因組文庫，經(jīng)α互補(bǔ)篩選獲得了呈現(xiàn)陽性的菌株，但PCR和酶切初步分析鑒定的結(jié)果中未有外源基因片段插入。對(duì)提取純化的病毒做紅外吸收定量分析表明，病毒的濃度太低，對(duì)病毒核酸的酶切電泳分析表明，所獲得的混合病毒核酸型無法確定，需要建立病毒的有效篩選途徑，來實(shí)現(xiàn)對(duì)不同病毒的檢測(cè)和進(jìn)一步分離。 為了對(duì)海水中病毒的數(shù)量和分布有所了解，我們采用新型熒光核酸染料SY