累托石納米顆粒有機(jī)改性前后細(xì)胞毒性的研究及其相關(guān)應(yīng)用的探討.pdf

1、累托石（Rectorite，REC）是一種規(guī)則層狀硅酸鹽粘土礦物，已被研究用于食品和醫(yī)療等領(lǐng)域，但其毒性方面的探討仍舊缺乏。紫杉醇（Paclitaxel，PTX）作為一種有效的抗腫瘤藥物，在實(shí)際的臨床應(yīng)用中仍然存在許多不足之處。在此，我們主要討論了REC有機(jī)改性前后細(xì)胞毒性作用大小的改變及相關(guān)毒性作用的機(jī)制，以及REC對(duì)紫杉醇納米纖維素膜藥物傳遞系統(tǒng)抑癌活性的影響。
　　本研究主要由以下兩部分組成：
　　第一部分鈣基累托石納

2、米顆粒有機(jī)改性前后的細(xì)胞毒性的研究
　　目的：在本研究中，我們通過分析REC有機(jī)改性前后理化性質(zhì)的改變，及其對(duì)于人張氏肝細(xì)胞及人肝癌細(xì)胞HepG2的毒性作用及相關(guān)機(jī)制，為REC及有機(jī)累托石（Organic modified rectorite，OREC）在未來應(yīng)用中的安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：用REC與十六烷基三甲基溴化銨陽(yáng)離子交換制備OREC并測(cè)定REC及OREC的粒徑大小和ζ電位；用熱重曲線分析兩者的熱穩(wěn)定性；用傅

3、里葉變換紅外光譜、透射電鏡和小角X射線衍射評(píng)價(jià)REC及OREC的層間距大小及化學(xué)組成；用能量色散X射線光譜判斷人張氏肝細(xì)胞中REC及OREC的攝入；濃度為0、1、2.5、5、7.5和10μg/mL的REC或OREC分別處理人張氏肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞6、24及48 h后，采用MMT法檢測(cè)其細(xì)胞毒性；濃度為0、1、2.5、5、7.5和10μg/mL的REC或OREC處理人張氏肝細(xì)胞24 h后，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡和壞死；0、1、2.

4、5、5、7.5和10μg/mL REC或OREC處理人張氏肝細(xì)胞6 h或24 h后，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和pro-caspase-3的表達(dá)。5μg/mL的REC或OREC處理HepG2細(xì)胞24后，掃描電鏡下觀察自噬小體并檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：REC在有機(jī)改性后，層間距增加。REC及 OREC處理人張氏肝細(xì)胞24 h后，納米顆粒被攝入細(xì)胞內(nèi)。1、2.5、5、7.5及10μg/mL的REC或OREC處理人張

5、氏肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞6、24和48 h后，均能觀察到細(xì)胞活性下降(P<0.05 or P<0.01)，且OREC所致的細(xì)胞毒性較REC大，兩種細(xì)胞間毒性作用沒有差異。7.5和10μg/mL的REC或OREC處理24 h后，人張氏肝細(xì)胞的凋亡壞死率均有提高(P<0.05 or P<0.01)。5、7.5、10μg/mL的REC或OREC處理人張氏肝細(xì)胞24 h后，Bax、Bcl-2及pro-Caspase-3的表達(dá)均有所下降，但Bax

6、/Bcl-2比值沒有變化，提示并非通過 Bax相關(guān)線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5μg/mL的REC或OREC處理HepG2細(xì)胞24 h后，均能在細(xì)胞內(nèi)觀察到自噬小體，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大，提示自噬的發(fā)生。
　　結(jié)論：研究結(jié)果表明，有機(jī)改性后，REC的理化特性在各方面均有較大的提升，但其細(xì)胞毒性也有明顯的增加。REC及OREC通過細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞自噬共同誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。在實(shí)現(xiàn)OREC在食品和醫(yī)療等領(lǐng)域的應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意其生物

7、安全性。
　　第二部分累托石對(duì)紫杉醇納米纖維素膜體外抑癌活性影響的研究
　　目的：我們以醋酸纖維素（Cellulose acetate，CA）作為輔料，采用靜電紡絲法制作紫杉醇醋酸納米纖維素膜（CA/PTX0.06及 CA/PTX0.12）及加入累托石（Rectorite，REC）的紫杉醇醋酸納米纖維素膜（CA/PTX0.06/REC及CA/PTX0.12/REC），并研究REC對(duì)納米纖維理化性質(zhì)、體外PTX藥物釋放行為以及

8、對(duì)人胃細(xì)胞毒性的影響。
　　方法：納米纖維素膜形貌，選用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察；布魯諾爾-埃米特-特勒比表面積，選用氮吸附法測(cè)定；復(fù)合納米纖維素膜的組成成分，由能量色散X射線測(cè)定；膜中PTX、CA、REC的相互作用，由傅里葉變換紅外光譜和廣角X射線衍射研究；熱穩(wěn)定性由差示掃描量熱法以及熱重分析確定；復(fù)合納米纖維素膜中PTX在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水的釋放行為，用高效液相色譜測(cè)定；人胃癌細(xì)胞SGC7901，以及人胃上皮細(xì)胞G

9、ES-1在納米纖維素膜上生長(zhǎng)24 h后，細(xì)胞毒性由LIVE/DEAD細(xì)胞活性/細(xì)胞毒性試劑盒測(cè)定，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡觀察。
　　結(jié)果： REC和PTX均被成功紡入復(fù)合納米纖維素膜。并且CA的熱穩(wěn)定性未受到影響。所有復(fù)合納米纖維素膜的纖維表面光滑，各樣本纖維間的形貌沒有明顯差別，在加入REC后比表面積有所增加。膜上種植細(xì)胞前后，所有的膜樣品均表現(xiàn)出典型的3D電紡納米纖維形貌。CA/PTX和CA/PTX/REC膜中PTX的釋放行

10、為保持相對(duì)穩(wěn)定緩慢，并且REC提高了藥物的釋放率。CA/PTX和CA/PTX/REC對(duì)SGC7901和GES-1細(xì)胞均有毒性，兩種細(xì)胞系的毒性作用沒有顯著區(qū)別，且CA/PTX/REC毒性均較CA/PTX大。所有的膜都能為GES-1和SGC7901細(xì)胞的附著和延伸提供良好的支架。
　　結(jié)論：CA及CA/REC均具有較高的細(xì)胞親和力，CA/PTX及CA/PTX/REC釋放PTX穩(wěn)定，且表現(xiàn)出一定的細(xì)胞致死能力。REC通過提高PTX的累