體外受精—胚胎移植中影響子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠結局的相關因素分析及GDF-9在子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡液和顆粒細胞中的表達.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮腔以外的任何部位而引起的一種疾病，為育齡婦女常見病、多發(fā)病，是引起女性不孕的常見原因之一。體外受精-胚胎移植(in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術的應用成為解決不孕癥的有效方法，但與其他因素不孕行IVF-ET治療的患者相比，子宮內(nèi)膜異位癥較差的妊娠結局給患者帶來很大的精神壓力和經(jīng)濟負擔。子

2、宮內(nèi)膜異位癥導致IVF-ET不良結局的因素紛繁復雜，包括生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)、卵子質(zhì)量、胚胎發(fā)育、胚胎植入及內(nèi)膜容受性改變等方面。目前很多研究已經(jīng)從上述層面分析了子宮內(nèi)膜異位癥與IVF-ET妊娠結局的關系，而其中卵母細胞質(zhì)量下降是影響其治療結局的關鍵因素之一。
　　卵母細胞的質(zhì)量體現(xiàn)了卵子內(nèi)在的發(fā)育潛能，質(zhì)優(yōu)的卵母細胞在正常受精、胚胎發(fā)育及著床的過程中起到至關重要的作用，并且對妊娠的建立和維持、胎兒的發(fā)育也具有深刻影響，因此在IVF

3、-ET中努力提高卵母細胞質(zhì)量意義重大。卵母細胞的發(fā)育包括生長和成熟兩個階段，其成熟與卵泡的生長相伴進行。同時，卵母細胞通過廣泛的縫隙連接，局部因子的自分泌及旁分泌功能與周圍的顆粒細胞進行信息交流，構成統(tǒng)一的整體。因此，從卵泡液的成分及顆粒細胞方面對卵母細胞質(zhì)量進行研究評估引起廣泛關注，而卵母細胞分泌因子（Oocyte secreted factors，OSFs）的發(fā)現(xiàn)又為研究卵母細胞質(zhì)量、預測胚胎質(zhì)量及妊娠結局提供了新的思路。在眾多卵母

4、細胞因子中，生長分化因子-9(growth differentiation factors，GDF-9)是最早被發(fā)現(xiàn)對卵泡發(fā)育具有重要作用，并且有研究發(fā)現(xiàn)，以正常婦女作對照，嚴重子宮內(nèi)膜異位癥婦女經(jīng)腹腔鏡穿刺大卵泡的卵泡液中，GDF-9水平下降明顯。
　　綜上所述，本研究第一部分通過回顧因子宮內(nèi)膜異位癥因素行IVF助孕患者的臨床及實驗室資料并與單純因輸卵管因素不孕者進行比較，探討影響子宮內(nèi)膜異位癥IVF-ET結局的相關因素;第二部

5、分通過測定子宮內(nèi)膜異位癥患者血清、卵泡液中GDF-9水平及黃素化顆粒細胞上GDF-9的蛋白及mRNA的表達，探討GDF-9與子宮內(nèi)膜異位癥的關系，力圖探索其影響卵母細胞質(zhì)量的可能途徑，以期為指導臨床治療提供理論依據(jù)及新思路。
　　第一部分、體外受精-胚胎移植中影響子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠結局的相關因素分析
　　目的:回顧性分析因子宮內(nèi)膜異位癥行體外受精-胚胎移植助孕患者的臨床及實驗室資料，并與單純因輸卵管因素者進行比較，探討影

6、響子宮內(nèi)膜異位癥IVF-ET結局的相關臨床和實驗室因素。
　　方法:對河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科2011年1月至2013年3月行常規(guī)IVF周期的患者，根據(jù)病因不同將子宮內(nèi)膜異位癥組作為實驗組（A組）、單純因輸卵管因素不孕者為對照組（B組）;其中又根據(jù)妊娠結局將A組分為妊娠組（A1組）、非妊娠組(A2組)。A組共129個周期，移植周期為114例，其中A1組60例，A2組54例;B組共1660個周期。①比較A、B兩組患者的一般資料

7、如年齡，不孕年限，體重指數(shù)(BMI)，血清基礎卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)水平，原發(fā)不孕與繼發(fā)不孕比例;②比較A、B兩組促排卵方案的構成比，促性腺激素(Gn)使用天數(shù)及用藥量，人絨毛膜促性腺激素(HCG)注射日（以下簡稱HCG日）血清LH、E2、孕酮(P)水平;③比較A、B兩組平均獲卵數(shù)、受精率、正常受精率、卵裂率、可移植胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、周期冷凍率，全胚冷凍率;④比較A、B兩組胚胎種植率及臨床

8、妊娠率、多胎率及流產(chǎn)率。⑤比較A1、A2兩組患者年齡、不孕年限、原發(fā)和繼發(fā)不孕比例、基礎性激素水平、使用Gn天數(shù)及用量、HCG日LH、E2、P水平以及各種方案構成比;⑥比較A1、A2兩組平均獲卵數(shù)、受精率、正常受精率、卵裂率、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、周期冷凍率等。
　　結果:1789個IVF周期中，子宮內(nèi)膜異位癥組共129個周期（A組），對照組1660個周期（B組）。①A、B兩組患者的平均年齡分別為31.29±4.31歲、29.

9、21±4.04歲，A組顯著高于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-5.275，P＜0.05);A、B兩組患者的不孕年限分別為4.57±3.99年、3.80±2.73年，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.064，P＜0.05);A、B兩組患者原發(fā)不孕的比例分別為62.80％、52.53％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(x2=5.035，P＜0.05);A、B兩組血清基礎FSH、LH水平分別為8.18±3.12mIU、3.95±1.79mI

10、U和7.88±3.73mIU、4.74±3.22mIU，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義（Z=-1.145，P＞0.05; Z=1.176，P＞0.05）;A、B兩組血清基礎E2水平為57.47±53.01pg/ml、44.92±32.32pg/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.011，P＜0.05);②A、B兩組患者促排卵方案（長方案、短方案、拮抗劑方案、超長方案）的構成比分別為26.3％、4.7％、10.9％、58.1％和78.4

11、％、5.2％、12.9％、3.4％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（x2=529.442，P＜0.05）;A、B兩組的Gn天數(shù)與Gn用量分別為10.78±2.25天、2896.90±824.71IU和10.13±2.12天、2375.85±764.96IU,兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(Z=-3.610，P＜0.05，Z=-7.548，P＜0.05);A、B兩組患者的HCG日血清LH、E2、P水平分別為1.69±1.77mIU/ml、2543.

12、88±1547.71 pg/ml、1.04±0.56ng/ml和2.23±2.54mIU/ml、3407.31±1444.48pg/ml、1.17±0.69ng/ml，兩組比較LH、E2及P水平差異均有統(tǒng)計學意義(Z=5.715，P＜0.05; Z=6.16，P＜0.05; Z=2.430，P＜0.05);③A、B兩組患者的平均獲卵數(shù)分別為9.69±7.17枚、13.67±7.83枚，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=6.508，P＜0.0

13、5);A、B兩組患者的受精率和正常受精率分別為73.60％、60.08％和84.32％、63.54％，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(x2=100.131，P＜0.05; x2=6.130，P＜0.05);A、B兩組患者的卵裂率分別為98.91％、98.90％，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(x2=3.617，P＞0.05);A、B兩組患者的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)分別為2.39±3.32個、3.86±3.91個，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=4.712，P＜

14、0.05);A、B兩組患者的可利用胚胎數(shù)分別為4.01±3.82個、5.94±4.27個，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=5.740，P＜0.05);A、B兩組移植胚胎數(shù)分別為2.00±0.51個、1.70±0.89個，兩組比較無統(tǒng)計學差異（Z=0.634，P＞0.05）;A、B兩組挽救ICSI(rescue ICSI，R-ICSI)率分別為2.29％、2.97％，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（x2=0.324，P＞0.05）;④A、B兩組患

15、者的周期冷凍率分別為44.96％、64.76％，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(x2=20.203，P＜0.05)，但兩組的全胚冷凍率分別為10.08％、16.20％，比較差異無統(tǒng)計學意義(x2=3.216，P＞0.05);A、B兩組胚胎種植率及臨床妊娠率分別為35.65％、52.63％和36.69％、53.89％，A組低于B組，但差異均無統(tǒng)計學意義（x2=0.068，P＞0.05; x2=0.099，P＞0.05）;A、B兩組的多胎率分別為

16、33.33％、30.11％，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(x2=0.280，P＞0.05);A、B兩組的流產(chǎn)率分別為11.67％、6.80％，A組高于B組，但差異無統(tǒng)計學意義（x2=2.044，P＞0.05）。⑤A1、A2兩組平均年齡、不孕年限分別為30.33±3.72歲、3.93±2.74年和32.33±4.72歲、5.18±5.26年，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.766，P＞0.05;Z=0.935，P＞0.05);A1、A2兩組

17、患者的原發(fā)不孕率為71.67％、33.33％，A1組顯著高于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(x2=16.788，P＜0.05);A1、A2兩組血清基礎FSH、E2水平分別為8.31±3.30mIU、59.46±62.22pg/ml和8.74±3.27mIU、55.15±51.52pg/ml，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(Z=1.086，P＞0.05;Z=-0.738，P＞0.05);兩組基礎LH水平為3.55±1.75mIU、4.31±

18、1.91 mIU，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.082，P＜0.05);A1、A2兩組平均使用Gn天數(shù)分別為10.17±3.84天、10.29±2.54天，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（Z=-0.609，P＞0.05）;A1、A2兩組平均Gn用藥量分別為2699±676.91IU、3132.1±923.58IU，A1組少于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=-2.758，P＜0.05）;A1、A2兩組HCG日E2水平為2691.9

19、0±1415.73pg/ml、2191.22±1513.05pg/ml，A1組顯著高于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.018，P＜0.05)。⑥A1、A2兩組的平均獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、可移植胚胎數(shù)分別為9.50±5.18枚、2.68±2.90個、4.30±3.00個和7.72±5.14枚、1.38±1.83個、2.81±2.12個，A1組均高于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.364，P＜0.05; Z=-2.40

20、1，P＜0.05;Z=-3.023，P＜0.05);A1、A2兩組受精率、正常受精率分別為74.56％、61.75％和74.10％、58.03％，A1組雖均高于A2組，但兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(x2=0.027，P＞0.05; x2=1.391，P＞0.05);A1、A2兩組卵裂率為98.82％、98.06％，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(x2=0.710，P＞0.05);兩組周期冷凍率為53.33％、24.07％，A1組顯著高于A2組，

21、兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(x2=10.184，P＜0.05)。
　　結論:子宮內(nèi)膜異位癥患者年齡偏大，不孕年限長，原發(fā)不孕比例高，在卵巢刺激中對促排卵藥物反應性差以及卵母細胞的受精異常，這些因素可能導致了臨床妊娠率、種植率偏低，流產(chǎn)率偏高;子宮內(nèi)膜異位癥中臨床妊娠者具有對促排卵藥物反應性好、胚胎質(zhì)量優(yōu)的特點。
　　第二部分、GDF-9在子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡液和顆粒細胞中的表達
　　目的:通過測定GDF-9在子宮內(nèi)膜異

22、位癥患者卵巢刺激中血清、卵泡液中的水平及黃素化顆粒細胞上GDF-9蛋白及其mRNA的表達，探討GDF-9與子宮內(nèi)膜異位癥患者卵母細胞質(zhì)量和IVF妊娠結局的關系，尋找其影響卵母細胞質(zhì)量的可能途徑。
　　方法:收集于2012年8月至2013年3月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科行體外受精-胚胎移植的子宮內(nèi)膜異位癥患者30例（A組）的血清、卵泡液及黃素化顆粒細胞，同時以同期單純因輸卵管不孕患者30例（B組），作為對照組。比較兩組一般指標

23、如年齡、基礎性激素水平(FSH、LH、E2)、Gn天數(shù)及用量、平均獲卵數(shù)、平均受精率、平均正常受精率、平均卵裂率、可移植胚胎數(shù)（率）、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（率）、胚胎種植率及臨床妊娠率等;用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定兩組血清、卵泡液中GDF-9水平;蛋白印記法測定兩組黃素化顆粒細胞中GDF-9蛋白表達;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reversetranscriptase-polym

24、erase chain reaction, RT-PCR)測定顆粒細胞上GDF-9mRNA表達;比較兩組血清、卵泡液中GDF-9水平、黃素化顆粒細胞中GDF-9蛋白及mRNA的表達;分析血清、卵泡液GDF-9水平、黃素化顆粒細胞中GFDF-9蛋白及mRNA表達與年齡、Gn天數(shù)及用量、獲卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)（率）、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（率）、受精率、卵裂率等的相關性。
　　結果:子宮內(nèi)膜異位癥組共30個周期（A組），對照組30個周期（B組）。①

25、A、B兩組女方的平均年齡分別為31.50±4.83歲、28.15±4.27歲，A組顯著高于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.080，P＜0.05); A、B兩組血清基礎FSH、LH、E2水平分別為8.31±3.62mIU、4.30±1.78mIU、58.88±49.27pg/ml和7.34±1.69mIU、4.42±1.76 mIU、43.72±36.81pg/ml，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義（Z=-0.412，P＞0.05;t

26、=-0.249，P＞0.05;Z=-1.224，P＞0.05）;②A、B兩組的Gn天數(shù)與Gn用量分別為11.17±1.42天、3010.83±655.19IU和9.55±1.28天、2184.20±580.00IU，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(Z=-4.080，P＜0.05;Z=-4.699，P＜0.05);A、B兩組患者的HCG日LH、E2水平分別為1.38±1.20mIU/ml、3066.37±1612.51pg/ml和2.02±1

27、.26mIU/ml、3846.06±1216.97pg/ml，A組均低于B組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(Z=3.142，P＜0.05; Z=2.016，P＜0.05);但A、B兩組患者的HCG日P水平分別為1.18±0.47ng/ml、1.14±0.69ng/ml，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.606，P＞0.05）;③A、B兩組患者的平均獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、可移植胚胎數(shù)分別為10.63±8.10枚、3.27±4.82個、4.47

28、±4.90個和15.15±8.23枚、5.28±5.12個、7.03±5.46個，A組均低于B組，兩組比較有統(tǒng)計學差異(Z=-2.792，P＜0.05; Z=-2.295，P＜0.05; Z=-2.380，P＜0.05);A、B兩組平均受精率為81.63％±15.72％、77.84％±17.52％，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=-0.700，P＞0.05);A、B兩組平均正常受精率分別為55.93％±22.05％、67.34％±15.

29、67％，A組低于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=-2.331，P＜0.05）;A、B兩組患者的平均卵裂率分別為97.46％±9.74％、97.67％±5.73％，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.351，P＞0.05); A、B兩組移植胚胎數(shù)分別為1.73±0.94個、1.76±0.79個，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.142，P＞0.05）;④A、B兩組的周期冷凍率分別為40％、66.66％，A組顯著低于B組，兩組比較差異有

30、統(tǒng)計學意義(x2=20.203，P＜0.05)，但兩組的全胚冷凍率分別為13.33％、15.15％，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（x2=0.042，P＞0.05）;A、B兩組胚胎種植率分別為30.77％、34.48％，臨床妊娠率分別為53.33％、60.60％，多胎率分別為60％和66.67％，流產(chǎn)率分別為20.00％、8.33％，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義（x2=0.172，P＞0.05; x2=0.063，P＞0.05; x2=0.10

31、5，P＞0.05; x2=0.630,P＞0.05）;⑤A、B兩組取卵日的血清、卵泡液中GDF-9的水平分別為153.47±9.81pg/ml、143.00±90.28pg/ml和204.40±137.65pg/ml、236.85±163.40 pg/ml，A組均明顯低于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.047，P＜0.05; Z=2.216，P＜0.05);A、B兩組黃素化顆粒細胞中GDF-9蛋白及mRNA表達分別為0.53±0

32、.17、0.57±0.21和0.72±0.19、0.75±0.18，A組均明顯低于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=3.615，P＜0.05;t=-3.699，P＜0.05);⑥A組黃素化顆粒細胞中GDF-9蛋白與與獲卵數(shù)、可移植胚數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈正相關(r=0.703，P＜0.05; r=0.644，P＜0.05;r=0.665，P＜0.05);A組黃素化顆粒細胞上mRNA表達與與獲卵數(shù)、可移植胚數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈正相關(r-=0，5

33、15，P＜0.05; r=0.569，P＜0.05; r=0.526，P＜0.05);B組黃素化顆粒細胞上GDF-9蛋白及mRNA與受精率呈正相關，(r=0.442，P＜0.05; r=0.430，P＜0.05)。⑦A1、A2組血清、卵泡液中GDF-9濃度分別為191.63±102.04pg/m、196.43±116.83pg/m和134.35±95.45pg/m、124.5699.70pg/m，A1組顯著高于A2組，兩組比較差異均有統(tǒng)

34、計學意義(Z=-2.288，P＜0.05; Z=-2.332，P＜0.05); A1、A2組黃素化顆粒細胞上GDF-9蛋白及mRNA表達水平分別為0.63±0.15、0.70±0.17和0.48±0.16、0.50±0.20，A1組均高于A2組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=2.485，P＜0.05; Z=-2.772，P＜0.05); B1、B2兩組血清、卵泡液中GDF-9濃度分別為256.52±157.45 pg/ml、279.24

35、±129.78 pg/ml和172.89±119.48 pg/ml、190.43±169.01 pg/ml，B1組顯著高于B2組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.156，P＜0.05; Z=-2.090，P＜0.05);B1、B2兩組顆粒細胞上GDF-9蛋白及GDF-9mRNA水平分別為0.70±0.22、0.68±0.22和0.70±0.17、0.78±0.14，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.210，P＞0.05;t=-1.