GeXP多重RT-PCR在疑似兒童肺炎支原體腦炎診斷中的敏感性研究.pdf

1、目的：肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)是引起小兒呼吸道感染的常見病原體之一。MP感染除引發(fā)呼吸系統(tǒng)炎癥外，還幾乎可以累及人體其他全部器官。神經(jīng)系統(tǒng)侵害是MP所導致肺外疾病中常見的類型之一。腦炎是MP感染累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)中最為常見的一種[1]。目前，對于兒童罹患肺炎支原體腦炎(Mycoplasma pneumoniae encephalitis，MPIE)的診斷尚沒有明確標準，治療也有很多爭議。
　

2、　目前MP感染的檢測方法包括腦脊液(cerbrospinal fluid，CSF) PCR、腦脊液病原體的培養(yǎng)、血清特異性IgM和IgG抗體測定等方法。血清抗體檢測雖方便易行，但僅抗體陽性不能確診，只能作為疑似病例。PCR和病原體培養(yǎng)可以作為確診MPIE的金標準，但兩種方法都存在著陽性率極低的缺點。對于那些有腦炎癥狀而金標準檢測陰性的患者如何確診，是臨床診斷中的難題，急需找到敏感可行的檢測手段，提高檢出率，確定病因，輔助治療。
　

3、　由于實驗技術手段的日益成熟，傳統(tǒng)的PCR技術已經(jīng)無法滿足需求，由此而誕生的多重PCR(multiplex PCR)是在同一個PCR反應體系中加上兩對或更多對的引物，并能同時擴增出相應多個核酸片段的PCR反應。而GeXP多重 RT-PCR(GeXP mRT-PCR)即為此原理。本研究預利用此方法診斷肺炎支原體腦炎，并與傳統(tǒng)的PCR法進行比較，分析GeXP多重RT-PCR在診斷肺炎支原體腦炎中的敏感性。
　　方法：
　　1、資

4、料收集：2015年5月至2016年8月河北省兒童醫(yī)院神經(jīng)內科病區(qū)收治的，初次入院的患兒100例(年齡32日-10歲，男女比例51:49)，以發(fā)熱伴頭痛為首發(fā)癥狀，有嗜睡，萎靡，嘔吐癥狀，后繼出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征的疑似腦炎的患兒，每位患兒在入院第一日或第二日采集1份腦脊液，1份靜脈血。
　　2、指標檢測：對采集的100份疑似腦炎患者的腦脊液進行病原體篩查。
　　(1)對所有標本進行常規(guī)腦脊液細菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性的標本可確診細菌

5、感染性腦炎。
　　(2)排除常見細菌性腦炎的剩余標本進行腦脊液抗酸染色檢查，抗酸陽性的標本可確診結核性腦膜炎。
　　(3)還未確診的標本進行腦脊液行普通涂片染色檢查，檢測新型隱球菌在內的微生物，排除其他微生物感染所致腦炎。
　　(4)細菌檢測陰性的標本進行病毒學檢測：GeXP多重RT-PCR法設計有甲型流感病毒等多種病毒引物(見表-1)，排除病毒性腦炎的病例。同時亦進行EBV血清IgM抗體檢測與腦脊液EBV DNA檢測

6、。
　　(5)對以上檢測全部陰性的標本進行支原體檢測。首先采用被動顆粒凝集法進行血清中的肺炎支原體IgM檢測，篩查出血清抗體陽性的疑似支原體腦炎患者，再對該病人的腦脊液分別采用GeXP多重RT-PCR和普通PCR法檢測，并對比分析檢測結果，探尋檢測支原體感染性腦炎的敏感方法。
　　(6)對所有標本進行腦脊液生化檢查(項目包括腦脊液葡萄糖含量測定、腦脊液蛋白含量測定、腦脊液氯離子含量測定、腦脊液腺苷脫氨酶測定，其中葡萄糖和蛋白

7、質含量作為主要參考指標)、腦脊液細胞學常規(guī)檢查，綜合上述檢測結果，作出最后的病原學診斷。
　　(7)最后測定的肺炎支原體陽性標本，進一步DNA測序鑒定。
　　3、分析的指標:(1)GeXP多重RT-PCR檢測法：標本最終經(jīng)過毛細管電泳呈現(xiàn)圖形顯示，肺炎支原體陽性結果中除3個內參峰，在核酸片段大小為216.8nt處出現(xiàn)特異的MP陽性峰。
　　(2)抗體顆粒凝集法結果顯示為(+++)時為陽性，顯示(-)，(+)，(++)時

8、均為陰性。
　　(3)對兩方法實驗結果綜合患者各項臨床指標和腦脊液實驗室檢查結果，最后確診是否為肺炎支原體腦炎，并比較檢出率差異。
　　4、統(tǒng)計分析：采用配對資料χ2檢驗查驗陽性率有無差異，檢驗水準α=0.05。
　　結果：
　　1、細菌學檢測結果：大腸埃希菌陽性1例，肺炎克雷伯菌陽性1例，金黃色葡萄球菌陽性2例，表皮葡萄球菌陽性1例，人葡萄球菌陽性2例，肺炎鏈球菌陽性7例，結核分支桿菌陽性4例，白色念珠菌陽性2

9、例(見表-2)。細菌性腦炎合計18例，真菌性腦炎2例。
　　2、病毒學檢測結果：排除上述病原體檢測陽性標本20例后，尚未確診的80例標本進行EBV檢測：結果顯示EBV IgM抗體和腦脊液EBV DNA均為陽性的標本共2例(見表-3)。
　　3、經(jīng)上述檢測后，尚剩余78例標本未確診，進行支原體檢測：采集的血清經(jīng)抗體顆粒凝集法檢測，19例血清支原體IgM陽性，視為可疑支原體腦炎病例。隨后將19例可疑腦脊液標本經(jīng)GeXP多重RT-

10、PCR分析系統(tǒng)檢測，得到8例陽性標本，陽性率為42％。而普通PCR法僅測出2例陽性結果。經(jīng)x2檢驗，P<0.05，兩種檢測結果存在統(tǒng)計學差異，GeXP多重RT-PCR法優(yōu)于普通PCR法(見表-4)。
　　4、最后檢測得到的8例陽性標本，由于兩種PCR結果不一致，故而將PCR產(chǎn)物送生物公司測序檢測，結果證明這8例均為肺炎支原體陽性結果(見附圖2)。
　　結論：
　　1、 GeXP多重RT-PCR法在檢測腦脊液肺炎支原體時