細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡在鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)生殖結(jié)節(jié)發(fā)育影響中相關(guān)作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分、DBP對(duì)SD大鼠生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育及雄激素水平的影響
　　目的：鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）是工農(nóng)業(yè)及生活用品上的常用塑化劑，可對(duì)環(huán)境造成污染。本實(shí)驗(yàn)研究妊娠期暴露DBP對(duì)雄性子代生殖系統(tǒng)，尿道下裂發(fā)生率及雄激素水平的影響。
　　方法：將SD大鼠孕鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和DBP組。懷孕13-19天，用灌胃法對(duì)DBP組孕鼠給予每天750毫克/千克體重溶于每只2ml玉米油的DBP，對(duì)照組給予

2、相應(yīng)量的玉米油作安慰劑。孕第19天，用4％水合氯醛將孕鼠麻醉后，剖宮取出胎鼠，判斷性別并計(jì)數(shù)，稱量體重，測(cè)量生殖結(jié)節(jié)到肛門(mén)距離（anogenital distance，AGD），生殖結(jié)節(jié)的長(zhǎng)度及直徑。對(duì)胎鼠生殖結(jié)節(jié)組織切片進(jìn)行HE染色，光鏡觀察組織結(jié)構(gòu)。將胎鼠斷頭取血，離心，取血清，用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）監(jiān)測(cè)血清睪酮水平。
　　結(jié)果：DBP組子代雄性胎鼠和

3、雌性胎鼠的比例較正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，但DBP組每窩活胎鼠個(gè)數(shù)的均數(shù)明顯低于正常對(duì)照組，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DBP組子代胎鼠與正常對(duì)照組相比，AGD明顯縮短，AGD/體重比例、生殖結(jié)節(jié)體積及生殖結(jié)節(jié)體積/體重比例明顯減?。╬<0.05）。DBP組雄性胎鼠尿道下裂發(fā)生率為43.64%，正常對(duì)照組未見(jiàn)尿道下裂。DBP組雄性胎鼠血清睪酮水平較正常對(duì)照組明顯降低，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。
　　結(jié)論：孕期暴露DBP能誘導(dǎo)子代胎鼠尿

4、道下裂的發(fā)生，能明顯抑制雄性子代胎鼠血清睪酮的合成，對(duì)雄性子代胎鼠生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育具有明顯影響。
　　第二部分、DBP對(duì)雄性SD大鼠胚胎期生殖結(jié)節(jié)自噬及凋亡的影響及機(jī)制
　　目的：研究孕期暴露DBP對(duì)雄性子代SD大鼠生殖結(jié)節(jié)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討孕期暴露DBP對(duì)雄性子代SD大鼠生殖結(jié)節(jié)細(xì)胞自噬相關(guān)通路的調(diào)控。
　　方法：尿道下裂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立同第一部分。孕第19天，取DBP組中的尿道下裂胎鼠及正常對(duì)照組

5、中胎鼠的生殖結(jié)節(jié)，制作冰凍切片，用TUNEL染色法檢測(cè)生殖結(jié)節(jié)細(xì)胞的凋亡情況；取子代雄性尿道下裂及正常對(duì)照組中胎鼠的生殖結(jié)節(jié)制作超薄切片，用透射電鏡法觀察生殖結(jié)節(jié)細(xì)胞中自噬結(jié)構(gòu)的改變；取尿道下裂及正常對(duì)照組胎鼠的生殖結(jié)節(jié)，提取總蛋白，用免疫印跡法檢測(cè)生殖結(jié)節(jié)組織中的自噬標(biāo)記蛋白（LC3，P62）以及自噬通路關(guān)鍵蛋白(Akt,p-Akt,p-mTOR,p-S6,Beclin-1)。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，尿道下裂組生殖結(jié)節(jié)中T

6、UNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多；自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I的比例顯著增高；p62蛋白表達(dá)明顯減少，均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05），而兩組Beclin-1的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)透射電鏡在尿道下裂胎鼠生殖結(jié)節(jié)中發(fā)現(xiàn)大量自噬小體及自噬溶媒體，而正常對(duì)照組中相對(duì)少見(jiàn)。尿道下裂組p-Akt,p-mTOR,p-S6蛋白明顯較正常對(duì)照組減少，而Akt的蛋白表達(dá)在兩組中無(wú)明顯差異（p<0.05）。
　　結(jié)論：孕期DBP的暴露能夠