周期性牽張力對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及膠原代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、本文分為兩個部分進(jìn)行探討：
　　論文Ⅰ 牽張力介導(dǎo)ACE2的表達(dá)及其對平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響
　　目的:
　　(1)探討周期性牽張力對血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響;
　　(2)明確ACE2在病理性牽張力(18％ elongation，1Hz)調(diào)節(jié)人主動脈平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用;
　　(3)明確病理性牽張力(18％ elongation，1Hz)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的分子機(jī)制。

2、　　方法：
　　1.人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)培養(yǎng)與處理
　　人主動脈平滑肌細(xì)胞株購自美國菌種保藏中心ATCC(American Type Cell Collection)，待平滑肌細(xì)胞生長至完全融合后，用吸管吸掉舊培養(yǎng)基，PBS沖洗細(xì)胞兩遍，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入適量事先預(yù)熱的0.25％胰蛋白酶，顯微鏡下觀察，至平滑肌細(xì)胞變圓后，輕輕拍打至細(xì)胞脫落，加入適量完全培養(yǎng)基中和胰酶，吹打細(xì)胞，使平滑肌細(xì)胞全部掉落，離心5mi

3、n(1000r/min)。離心結(jié)束，用吸管吸掉上清，加入新的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入含5％ CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待平滑肌細(xì)胞貼壁完全后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及密度。
　　2.動物模型的建立
　　我們應(yīng)用大鼠腹主動脈縮窄模擬血管壓力負(fù)荷升高，20只雄性Wistar大鼠(200-250g)隨機(jī)分為兩組:腹主動脈縮窄組(n-10)和對照組(n=10)，分別于術(shù)后3、5及7天后取材。
　　

4、3.實(shí)時熒光定量PCR分析
　　刺激結(jié)束后利用Trizol法提取平滑肌細(xì)胞中的總RNA，并測定RNA濃度。根據(jù)試劑盒說明，使用TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再使用TaKaRa公司的實(shí)時定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值，用相對定量的方法計算2-ΔΔCt，并分析數(shù)據(jù)。以測定平滑肌細(xì)胞內(nèi)ACE2及ACE的mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.周期性牽張力對平滑肌細(xì)胞內(nèi)ACE2、AC

5、E、Ang(1-7)、AngⅡ表達(dá)的影響
　　在時間-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，18％機(jī)械牽張力能夠抑制ACE2的表達(dá)，在12小時時間點(diǎn)達(dá)到最大抑制效應(yīng)(p＜0.01)，同時ACE2的活性下降(p＜0.05);而18％機(jī)械牽張力促進(jìn)ACE的表達(dá)(p＜0.05)，其mRNA于刺激后12小時達(dá)到峰值(p＜0.01);18％機(jī)械牽張力作用3、6小時后，AngⅡ、Ang(1-7)水平比0小時對照組無明顯變化，18％牽張力作用12h后，AngⅡ水平顯著增

6、加(P＜0.01)，而Ang(1-7)水平顯著降低(P＜0.01)，且這一趨勢持續(xù)至機(jī)械牽張力刺激24小時。
　　在張力-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，與靜止對照組相比，18％機(jī)械牽張力刺激12小時后，ACE2表達(dá)下降(p＜0.05)、活性降低(p＜0.05);與生理牽張力刺激組相比，18％牽張力刺激12小時后，ACE2表達(dá)下降(p＜0.05)、活性降低(p＜0.01)。而18％牽張力作用12小時后，其ACE表達(dá)比靜止對照組顯著增加(p＜0.01)

7、，比生理牽張力刺激組亦顯著增加(p＜0.01)。與靜止對照組相比，18％牽張力干預(yù)平滑肌細(xì)胞12小時后，AngⅡ水平升高明顯(P＜0.01)，而Ang(1-7)水平降低明顯(P＜0.01);與生理牽張力刺激組相比，AngⅡ水平亦升高明顯(P＜0.01)，Ang(1-7)水平亦降低明顯(P＜0.01)。
　　2.體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證壓力負(fù)荷對血管平滑肌細(xì)胞ACE2及ACE表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比，大鼠腹主動脈縮

8、窄5及7天后，ACE2表達(dá)下降(P＜0.01);而大鼠腹主動脈縮窄7天后，ACE表達(dá)升高(P＜0.01)。WesternBlot結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比，大鼠腹主動脈縮窄5及7天后，ACE2表達(dá)下降(P＜0.01）;而ACE表達(dá)升高(P＜0.01)。
　　3.ACE2對病理性牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及膠原代謝的影響
　　Brdu摻入法結(jié)果提示:與Ad-GFP組相比，Ad-GFP+stretch組促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖(P

9、＜0.01);與Ad-GFP+ stretch組相比，Ad-ACE2+ stretch組抑制平滑肌細(xì)胞增殖(P＜0.05)。
　　細(xì)胞劃痕試驗(yàn)表明:與Ad-GFP組相比，Ad-GFP+stretch組促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的遷移（P＜0.01）;與Ad-GFP+ stretch組相比，Ad-ACE2+ stretch組抑制平滑肌細(xì)胞遷移(P＜0.05)。
　　Western Blot結(jié)果提示:與Ad-GFP組相比，Ad-GFP+st

10、retch組膠原表達(dá)升高(P＜0.05);與Ad-GFP+ stretch組相比，Ad-ACE2+ stretch組膠原表達(dá)沒有明顯變化(P＞0.05)。
　　以上結(jié)果表明， ACE2參與病理性牽張力(18％ elongation，1Hz)對平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)節(jié)，但是不參與對膠原代謝的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)論：
　　(1)病理性牽張力抑制ACE2及Ang(1-7)的表達(dá)，促進(jìn)ACE及AngⅡ的表達(dá);
　　(2)AC

11、E2參與病理性牽張力對平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)節(jié)，不參與對膠原代謝的調(diào)節(jié);
　　(3)p38、ATF3及miR-421參與病理性牽張力對ACE2的調(diào)節(jié)作用。
　?、?牽張力介導(dǎo)P4Hα1/MMPs的表達(dá)及其對平滑肌細(xì)胞膠原代謝的影響
　　目的:
　　(1)探討周期性牽張力對血管平滑肌細(xì)胞P4Hα1、MMPs、TIMP-1、TIMP-2及膠原表達(dá)的影響;
　　(2)明確病理性牽張力(18％ elongatio

12、n，1HZ)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞P4Hα1及MMP-2表達(dá)的分子機(jī)制;
　　(3)研究ACE2對血管平滑肌細(xì)胞P4Hα1、MMP-2表達(dá)的影響。
　　方法:
　　人主動脈平滑肌細(xì)胞株購自美國菌種保藏中心(ATCC)，待平滑肌細(xì)胞生長至完全融合后，用吸管吸掉舊SMCM，PBS沖洗細(xì)胞兩遍后，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入事先預(yù)熱的0.25％胰蛋白酶，擰緊瓶蓋，顯微鏡下觀察，待平滑肌細(xì)胞變圓后，輕輕震蕩至細(xì)胞脫落，加入適量培養(yǎng)基中和胰酶

13、，吹打細(xì)胞，使平滑肌細(xì)胞掉落，移至離心管中，離心5min(1000r/min)。離心結(jié)束，棄掉上清，加入新的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶放入含5％ CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第4-7代HASMCs用于實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.病理性牽張力對人主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)P4Hα1、MMPs及TIMPs裹達(dá)的影響
　　在時間-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，病理性牽張力(18％ elongation，1HZ)能夠促進(jìn)P4Hα1的表達(dá)，在12

14、小時時間點(diǎn)達(dá)峰(p＜0.05)。明膠酶譜法檢測MMPs的活性，發(fā)現(xiàn)18％牽張力刺激可以增加HASMCs中MMP-2的活性(p＜0.05)，但在該實(shí)驗(yàn)中未能檢測出MMP-9的活性。RT-PCR及Westem blot檢測發(fā)現(xiàn)，病理性牽張力能夠促進(jìn)MMP-2的表達(dá)(p＜0.05)。而病理性牽張力刺激對TIMP-1及TIMP-2的表達(dá)沒有明顯影響(p＞0.05)。
　　在張力-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，與靜止對照組及生理牽張力刺激組相比，病理性牽張力

15、刺激12小時后，P4Hα1顯著升高(p＜0.01)。應(yīng)用明膠酶譜法檢測，10％及18％牽張力均能升高平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-2的活性(p＜0.01)，而與10％牽張力組相比，18％牽張力升高M(jìn)MP-2活性的程度更為明顯(p＜0.01)。RT-PCR及Weaernblot結(jié)果提示，與靜止對照組及生理牽張力刺激組相比，18％機(jī)械牽張力能夠促進(jìn)MMP-2的表達(dá)(p＜0.05)。同樣，10％及18％牽張力刺激平滑肌細(xì)胞12小時后，平滑肌細(xì)胞內(nèi)TIM

16、P-1及TIMP-2的表達(dá)沒有明顯影響(p＞0.05)。
　　2.病理性牽張力對人主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原表達(dá)的影響
　　應(yīng)用ELISA及Western blot檢測平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果提示，病理性牽張力(18％ elongation，1Hz)刺激平滑肌細(xì)胞12小時后，膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的表達(dá)水平顯著升高(p＜0.05)。
　　3.MMP-2及P4Hα1參與病理性牽張力對膠原代謝的影響
　　我們應(yīng)用si

17、RNA干擾MMP-2及P4Hα1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-2 siRNA及P4Hα1siRNA能升高或降低病理性牽張力(18％ elongation，1Hz)引起的膠原蛋白的表達(dá)，證明在病理性牽張力作用下，MMP-2及P4Hα1參與對膠原的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)論：
　　(1)病理性牽張力(18％ elongation，1Hz)上調(diào)P4Hα1、MMP-2及膠原的表達(dá)，對TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)沒有影響;
　　(2)18％牽張