白腐真菌木質(zhì)素降解酶的合成、定點(diǎn)突變、畢赤酵母表達(dá)以及它們對造紙工業(yè)中木質(zhì)纖維原料降解的研究.pdf

1、造紙工業(yè)是污染非常嚴(yán)重的行業(yè)之一，減少造紙行業(yè)污染的關(guān)鍵是木質(zhì)素的有效降解。漆酶(lacease)、錳過氧化物酶(manganese peroxidase)、木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidase)是三種主要的木質(zhì)素降解酶，它們組成的復(fù)合酶系是自然界中最高效的降解木質(zhì)素的酶系。本研究對這三種酶的分子改造、酵母表達(dá)、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)和對木質(zhì)素的降解效果進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為今后將其應(yīng)用于造紙工業(yè)的制漿和漂白過程提供了理論和實(shí)

2、踐依據(jù)。 針對目前主要的幾種基因合成方法具有步驟復(fù)雜、耗時、出錯率高、費(fèi)用昂貴等弊端，我們運(yùn)用OE-PCR技術(shù)和DNA Works軟件，通過采用40nt長的引物、分散基因中的AT堿基、提高退火溫度、使用高保真的PrimerSTAR DNA聚合酶等措施，成功建立了一個基因合成與定點(diǎn)突變平臺。該平臺不但可以簡單、快速、低成本地合成任何已知序列的基因，而且可以極大地減少基因合成中堿基的缺失和突變。此外，運(yùn)用該平臺還可以很容易地實(shí)現(xiàn)基因

3、的定點(diǎn)突變。在本研究中，我們應(yīng)用這個平臺成功合成了具有酵母密碼子偏好性的黃孢原毛平革菌錳過氧化物酶和灰蓋鬼傘菌過氧化物酶。在研究工作中，為了從沒有藍(lán)白反應(yīng)的克隆中篩選到所需的轉(zhuǎn)化子，我們在經(jīng)典的堿裂解法基礎(chǔ)上發(fā)展了一種用NaOH一步裂解法篩選重組子的快速鑒定方法，該方法快速而簡單，可以高通量地從轉(zhuǎn)化平板中篩選到所需的重組克隆，尤其適合篩選高拷貝、沒有藍(lán)白反應(yīng)的重組克隆。上述兩個技術(shù)平臺的建立為本課題的順利開展提供了技術(shù)保障。 野

4、生的灰蓋鬼傘菌過氧化物酶(Cip)酶活低，并且在高溫、高pH情況下容易失活，這給它在造紙工業(yè)上的應(yīng)用帶來了限制。我們根據(jù)文獻(xiàn)上的報道，利用上面建立的技術(shù)平臺對野生型的Cip基因進(jìn)行了一系列定點(diǎn)突變，并分別獲得了具有4、6、7個氨基酸突變位點(diǎn)的Cip突變酶基因。我們將上述野生酶和突變酶基因分別連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA上，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，獲得了重組Cip酶和突變Cip酶。對這些酶酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，野生型酶在表達(dá)的

5、第五天達(dá)到最大值，1.519955×105IU/L，最適反應(yīng)pH2.2，最適反應(yīng)溫度45℃，pH＞3時酶活和酶穩(wěn)定性迅速下降，30-80℃度都不穩(wěn)定。突變酶的酶學(xué)特性都有都有不同程度改善，其中整體酶學(xué)特性最好的突變酶是cipmt7，它在第六天表達(dá)酶活最高，為2.74836×10SIU/L，最適反應(yīng)pH為3.4，向中性pH值方向偏移2.2單位，pH2.2-5.6之間活性在60％以上，反應(yīng)pH范圍和野生相比向中性pH值方向偏移了2.6個單位

6、，在pH5.6時野生型酶活性幾乎為0，而cipmt7仍有61％的活性，在pH4.0時25℃保溫7個小時，野生型的酶活只剩下30％，而cipmt7仍有60％活性，高溫穩(wěn)定性也有大幅度的提高。 錳過氧化物酶(Mnp)是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一，在紙漿生物漂白、有機(jī)污染物降解、染料脫色、褐煤生物降解等方面有著廣泛應(yīng)用。但是利用白腐真菌發(fā)酵獲得Mnp，周期長，營養(yǎng)要求高，得率低不適合工業(yè)應(yīng)用。我們利用上面建立的基因合成技術(shù)平臺將Mnp基因

7、進(jìn)行了酵母密碼子的最適化，然后重組到畢赤酵母中進(jìn)行大量表達(dá)，并對重組酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。結(jié)果表明重組酶的酶活為誘導(dǎo)96小時活性最高，達(dá)2.565432×105IU/L，最適pH為3.6，pH＞4時酶活和pH穩(wěn)定性迅速下降，最適反應(yīng)溫度為40℃，30-50℃比較穩(wěn)定，50℃保溫1小時活性剩余50％。 漆酶(Lac)也是一種重要的木質(zhì)素降解酶。在造紙工業(yè)中應(yīng)用漆酶的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)是如何獲得大量的、廉價的漆酶資源及如何提高漆酶

8、在工業(yè)環(huán)境下降解木質(zhì)素的能力。利用畢赤酵母高效表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)是提高漆酶產(chǎn)量的一條有效途徑。但我們獲得的天然云芝漆酶基因中含有過多的酶切位點(diǎn)，給重組表達(dá)載體的構(gòu)建及線性化帶來很大的不便。為此我們根據(jù)密碼子的擺動性和酵母密碼子的偏好性設(shè)計了引物對該基因進(jìn)行改造，去掉基因內(nèi)部的EcoRI，SacI位點(diǎn)，在5'端加上EcoRI，3'端加上XbaI位點(diǎn)。然后構(gòu)建表達(dá)載體將將基因重組到畢赤酵母中大量表達(dá)，并對重組酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。