利用分子生物學(xué)技術(shù)對偽角毛蟲屬及全列蟲屬纖毛蟲的分類學(xué)及系統(tǒng)學(xué)研究.pdf

1、纖毛蟲原生動物是最復(fù)雜和最高等的單細胞真核生物,由于其獨具的兩型核、復(fù)雜的細胞發(fā)生過程和獨特的接合生殖方式,因而在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和核.質(zhì)關(guān)系的研究上均具有重要的研究價值。 由于傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)至今存在大量混亂,這就給后續(xù)工作的開展帶來很大的困難。而分子標(biāo)記從基因水平反應(yīng)物種的遺傳變異、生物多樣性及其進化時序,從而可有效解決纖毛蟲傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上的若干存疑?；诖?本工作就纖毛蟲在分類和系統(tǒng)歸屬上的混亂和疑點,利用多種分

2、子生物學(xué)技術(shù)(RAPD,PCR-RFLP,PCR-SSCP,SSrRNA基因和ITS1-5.8S-ITS2基因序列比較)對分類地位爭議較多的全列蟲屬、偽角毛蟲屬中的若干種進行了分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)兩個層次上的研究,并對構(gòu)建基因樹的若干影響因素進行了探討。 一、分類學(xué) 本工作利用RAPD,PCR-RFIP,PCR-SSCP等分子標(biāo)記及基因測序技術(shù),對偽角毛蟲和全列蟲屬的多個形態(tài)相似種進行了種類區(qū)分和鑒定,并對四種偽角毛蟲的親緣關(guān)

3、系進行了探討,從基因水平為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)提供了可靠的依據(jù)。 1.對黃色偽角毛蟲兩個種群三個克隆株的SSrRNA基因進行了序列測定,均包含1770bp,比較顯示兩個種群間僅存在兩個堿基對的差異,種群內(nèi)不同克隆株之間完全不存在差異。利用四種隨機引物對兩個種群三個克隆株進行了隨機擴增,所得條帶顯示種群間存在細微的譜帶差異;同種群內(nèi)不同克隆株之間不存在譜帶差異,但存在一定程度的強弱差別。實驗證實,偽角毛蟲屬確實是一個處于活躍分化期的階元,其

4、分化或變異不僅表現(xiàn)在種間,同時也體現(xiàn)在種下甚至不同的克隆間。 2.利用十一種隨機引物對三種偽角毛蟲和五種全列蟲進行了種間及種內(nèi)關(guān)系的RAPD分析,所得清晰條帶顯示種問均具有明顯的差異。利用RAPDistance軟件構(gòu)建的鄰接(NJ)樹表明：偽角毛蟲屬與全列蟲屬之間能很好地分開，而不同種群間表現(xiàn)了很好的同源性。 3．利用核糖體DNA限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，檢測了偽角毛蟲屬的多個形態(tài)相似種。各株系差

5、異顯著的PCR-RFLP指紋圖譜支持形態(tài)學(xué)對偽角毛蟲屬的區(qū)分和定義。分析表明，PCR-RFLP之多態(tài)性指紋圖譜作為纖毛蟲傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)的輔助手段，可以有效地進行種類區(qū)分。同時，我們的研究表明，PCR-RFLP有時可將種群區(qū)分開。 4．利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)技術(shù)，檢測了偽角毛蟲屬(Pseudokeronopsis)四個形態(tài)相似種的六個種群。實驗證明，ITSl基因的PCR-SSCP圖譜可以很好地用于偽角毛蟲屬形態(tài)相似

6、種的種間及種群區(qū)分。 5．首次測定了四種五種群偽角毛蟲的ITSl-5.8S-ITS2基因全序列，長度均為480bp左右；同時測定了四種偽角毛蟲SSrRNA基因全序列，長度約為1770bp;利用幾種序列構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)樹均表明：肉色偽角毛蟲與黃色偽角毛蟲親緣關(guān)系較近，而青島偽角毛蟲與偽角毛蟲未定種親緣關(guān)系較近。 二、系統(tǒng)學(xué) 本工作首次測定了柔弱全列蟲，以及在形態(tài)上十分特殊的的青島偽角毛蟲的SSrRNA基因全序列

7、，以Phylip軟件中的鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)關(guān)系樹，以Paup軟件構(gòu)建了最大簡約樹，以Mrbayes軟件構(gòu)建了最大似然樹。通過比較和分析幾種系統(tǒng)關(guān)系樹中各分類階元間的進化關(guān)系，表明全列蟲屬、偽角毛蟲屬極可能均非單系發(fā)生，同時本研究從分子生物學(xué)角度支持了二者之間較近的親緣關(guān)系。 三、系統(tǒng)樹構(gòu)建 以纖毛蟲動物中的幾個屬的部分SSrRNA基因為研究對象，初步探討了不同外類群、內(nèi)類群的選擇，有無外類群，同一基因不同長度，不同構(gòu)樹方法